蚯蚓肠道菌群对土壤中抗生素的响应机制开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

选题背景：

四环素类抗生素由于其广谱性和价格低廉被广泛应用于畜禽养殖及水产养殖业，但这些抗生素却不能完全被机体吸收，而大部分以原形或代谢物形式经粪便排出体外，并随着粪肥农用最终在土壤中吸附累积，造成污染，进而危害农业土壤生态安全。近年来，生物修复技术受到人们的广泛关注。中国农业土壤普遍检出四环素类抗生素，其中土霉素、金霉素和四环素的质量分数分别为 0~8 400、0~5 520 和 0~2 450 μg·kg-1；部分样点土壤中四环素类抗生素的含量超出了兽药国际协调委员会（vich）筹划指导委员会提出的土壤抗生素生态毒害效应的触发值（100 μg·kg-1），具有一定生态风险。研究表明，相对四环素，土壤残留的土霉素和金霉素生态风险较高。此外，文献调研指出，中国农业土壤四环素类抗生素主要来源于畜禽粪肥的施用。一般情况下，粪肥施用量越大，施用时间越长，土壤残留四环素类抗生素的含量就越高。生物降解主要是利用环境中本身存在的或构建的特殊工程微生物，将目标污染物转化为无害物质，具有成本低，效果好且环保的优点。而蚯蚓是生态系统的重要组成部分，约占土壤动物总量的60%，在维持土壤生态系统稳态方面发挥重要作用。

选题意义：

2. 研究的基本内容和问题

研究目标、内容：

1）每隔两小时测定不同浓度四环素作用下蚯蚓肠道内容物产生的二氧化碳、二氧化氮、甲烷、硝酸盐、亚硝酸盐、细菌群落变化情况；

2）每隔两小时测定没有四环素作用下蚯蚓肠道内容物产生的二氧化碳、二氧化氮、甲烷、硝酸盐、亚硝酸盐、细菌群落变化情况；

3. 研究的方法与方案

科学假设：

低浓度四环素对蚯蚓肠道中产甲烷和反硝化具有促进作用，高浓度四环素对产甲烷和反硝化具有抑制作用。

实验方案：

4. 研究创新点

蚯蚓肠道菌群分离筛选与鉴定的方法：

首先选取有明显环带并且体重在一定范围内的新鲜蚯蚓，对其体表进行清洗后进行麻醉处理。然后进行解剖，取其肠道内容物；使用无菌水将肠道内容物稀释成一定的浓度梯度，不同浓度的稀释液在含有不同种类及含量抗生素的改良lb固体平板上进行涂布，之后进行培养、筛菌、纯化。将纯化好的菌落于改良lb液体培养基中进行培养，培养完成后，用细菌dna提取盒提取dna；将提取的dna进行16s rrna扩增，用质量百分浓度为2%的凝胶电泳检测扩增产物；将扩增产物进行测序分析，得到序列之后在ncbi上进行对比。

提取蚯蚓肠道内容物的工作原理是:1、蚯蚓最佳生长环境所需温度为20-25℃,温度过低或过高都会影响蚯蚓的新陈代谢。在低温条件下,蚯蚓的新陈代谢减慢,甚至会出现休眠或者滞育现象。取回新鲜蚯蚓放在冰上,会降低蚯蚓的活性,减少蚯蚓的排龚量,为之后获取更多更新鲜的蚯蚓肠道内容物提供方面。另外,将蚯蚓放在冰上,蚯蚓的活性降低,更容易用50%无水乙醇将蚯蚓麻醉或致死。2、蚯蚓有口、食道、砂囊、胃、生殖器、肠道、肛门等重要的器官,其中,口、食道、砂囊、胃、生殖器等器官一般在雄孔之前,肠道的位置从雄孔左右开始到肛门结束。因此,在解剖蚯蚓时,为了更准确的获取肠道内容物,一般在雄孔下方的位置进行解剖。蚯蚓背部及腹部中间各有一条贯穿全身的血管,解剖在中间偏左或者偏右的位置进行,是为了尽量避免将血管剪断,有较多血迹而造成较大的误差。3、pbs具有调节渗透压的作用,并且ph值在7.4左右,与蚯蚓肠道酸碱性相近,对保持蚯蚓肠道内容的新鲜度有很大作用。

5. 研究计划与进展

1）熟悉课题内容，查阅相关文献（10篇以上）；

2）收集资料，分析实验的重点、难点，并与导师师姐讨论相关解决方法；

3）进一步完善实验设置，并做好实验准备；