1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
课题的意义：壤生态系统与温室气体排放关系密切。蚯蚓参与调控土壤的能量流动和物质循环过程，对土壤温室气体 如 n2o 的产生与排放产生重要影响，四环素对蚯蚓的生长发育有着重大的影响，影响整个土壤系统的平衡，四环素作为一种抗生素对生态系统也有着重大负面影响，通过研究四环素对蚯蚓的影响，从而发现他们之间平衡的关系，使的四环素对于蚯蚓有一个正向的帮助，从而保证生态系统的平衡。
国内外研究进展：国内的实验室通过采用室内模拟实验，研究了土壤四环素污染对赤子爱胜蚓(eisenia foetida)生长发 育、抗氧化系统及基因表达的毒性效应。结果表明:与对照组相比，四环素暴露初期(≤14 d)，蚯蚓体重及可溶性蛋白(sp)含量变化不显著;随着暴露时间的延长及四环素浓度的增 加，蚯蚓体重呈现下降趋势，sp 含量显著上升。1 ～ 100 mg·kg － 1四环素胁迫下，蚯蚓体内 抗氧化防御系统遭到破坏，暴露 14 d 后蚯蚓体内 sod、pod 和 cat 活性均有不同程度的上 升。ddＲt-pcＲ 试验结果显示，1 ～ 100 mg·kg － 1四环素胁迫下，暴露 28 d 后的蚯蚓基因表 达发生变化。研究表明，四环素对蚯蚓具有慢性生态毒性效应，可以综合运用抗氧化酶和基因表达等生物标志物评价四环素的生态毒性。
应用前景：通过控制四环素的浓度使的蚯蚓对硝化作用和反硝化作用最优，使的生态系统稳定性加强，使的各个食物链中的生物栖息环境最好。
2. 研究的基本内容和问题
研究目标;不同浓度的四环素对蚯蚓肠道中产生甲烷和和反硝化是否有促进作用吗？
内容：四环素等抗生素在短期内不会对土壤生物引起 急性毒性效应，但是由于被持续不断地输入到土壤 中，具有类持久性，因此对于这类污染物长期存在下给土壤生物带来的慢性毒性效应不容忽视四环素 能特异性的与微生物核糖体结合，阻止肽链的增长， 抑制蛋白质的合成，且四环素进入生物体内后，会通 过与相关蛋白质作用，破坏蛋白质原有生物活性和 功能，而对生物产生毒害，，在土壤四环素浓度为 1 mg· kg － 1时，土壤磷酸酶和脱氢酶活性受到了显著抑制;
微克级别的四环素浓度对土壤微生物依然具有显著 影响，研 究 发 现，含 有 10 μg·kg － 1四环素的土壤在培养 8 周后土壤微生物代 谢开始减弱，受到显著抑制，在这一过程中，土壤微 生物的抗药性也被诱导增强，且再次添加四环素至 10 mg·kg － 1时土壤才能与初始的 10 μg·kg － 1四环 素污染土壤对微生物的抑制效果相当;此外，四环素对植物生长发育、抗氧化酶活性等也具有一定的生态毒理效应，而蚯蚓通过取食、消化、排泄(蚯蚓粪)、分泌(粘液)和掘穴等活动对土壤过程的物质循环和能量传递作贡献,是对多个决定土壤肥力的过程产生重要影响的土壤无脊椎动物类群(主要是蚯蚓、螨和蚂蚁)之一,被称为“生态系统工程师”。如果抗生素破坏蚯蚓的栖息环境，从而会使的整个生态系统崩溃，影响动植物的生长发育。
3. 研究的方法与方案
科学假设：低浓度四环素对蚯蚓肠道中产甲烷和反硝化具有促进作用，高浓度四环素对》烷和反硝化具有抑制作用实验设置：
1、配制四环素溶液（需避光，四环素见光分解）
1.1配制四环素母液：100ppm
o，01g四环素溶于100m1 PBS
1.2配制四环素溶液
四环素浓度：0、20、40、60、80、I()()ppm
四环素的浓度按照肠道内容物的质量来算，每个血清瓶的整个体系为40m1，
道内容物4g：PBS 40m1：1： 10，若肠道内容物四环素浓度20ppm，整个体系四环
度则被稀释为2ppm。
具体配置如下：
|
| PBSml | 抗生素ml | 7瓶总体系ml |
| Oppm(G） | 300 | 0 | 300 |
| Oppm(P) | 300 | 0 | 300 |
| 2PPM | 294 | 6 | 300 |
| 4PPM | 288 | 12 | 300 |
| 6PPM | 282 | 18 | 300 |
| 8PPM | 276 | 24 | 300 |
| 10PPM | 270 | 30 | 300 |
上述四环素溶液避光保存，以备后用
2、解剖蚯蚓，获取肠道内容物（需要140g肠道内容物）
2．1对蚯蚓进行称重，挑选3巧g的蚯蚓
2，2清洗蚯蚓表面2·3遍
2．3用50％酒精麻醉蚯蚓2min 2，4解剖蚯蚓获取肠道内容物
以上步骤全部在冰上进行，保证蚯蚓肠道内容物的新鲜
2，5将蚯蚓肠道内容物分装成5份，每份28g，放在500m1的烧杯（置于冰块上）
将1.2配7个血清瓶，每个血清瓶40m1，分装好之后，标记如下：
| GO-0 | GO-2 | GO-4 | GO-6 | GO-8 | GO-10 | GO-12 |
| PO-0 | PO-2 | PO-4 | PO-6 | PO-8 | PO-10 | PO-12 |
| 20-0h | 20-2h | 20-4h | 20-6h | 20-8h | 20-10h | 20-12h |
| 40-0h | 40-2h | 40-4h | 40-6h | 40-8h | 40-10h | 40-12h |
| 60-0h | 60-0h | 60-0h | 60-0h | 60-0h | 60-0h | 60-0h |
| 80-0h | 80-2h | 80-4h | 80-6h | 80-8h | 80-10h | 80-12h |
| 100-0h | 100-2h | 100-4h | 100-6h | 1008h | 100-10h | 100-12h |
3每隔2h进行取样，样品：10ml气体，肠道混合物
测定指标：二氧化碳，氧化亚氮，甲烷，硝酸盐，亚硝酸盐，细菌群落
说明;GO-0h:有肠道内容物和ps溶液，无四环素0小时
Po-0h:无肠道内容物和四环素溶液，只有PBS溶液，0小时
20-0h：有肠道内容物和四环素溶液，0小时
4. 研究创新点
蚯蚓的肠道构成一个可移动的缺氧微区，加氧之后土壤中的微生物所受处理后，肠道通过时，蚯蚓肠道的原位因子出现，包括缺氧和高氧浓度底物从而极大地刺激了一部分摄入土壤微生物，包括反硝化细菌和发酵细菌，而进入蚯蚓肠道的通常是有机材料和土壤的混合物，而咽中的唾液有含有淀粉酶和蛋白酶的黏液修改了摄入的土壤，有助于帮助肠道运动中的粗干物质，如果我们可以模拟做出蚯蚓肠道的最佳适应环境，把此下的四环素浓度试用于不同的生物，是否会促进它们的生活环境？这个浓度是促进还是抑制?需要我们在实验中进一步探究。
5. 研究计划与进展
计划在四个周期内做出四环素对蚯蚓肠道影响的两组数据，其中包括促进的一组浓度和抑制的一组浓度，并且测出四环素在大的毒性效应，把实验室的数据可应用于一小部分的土地中，从而全面的推广，减少因四环素的毒性而影响生物的栖息环境。
展望：
抗性基因污染是一个全球性的问题, 但目前我国 的研究还比较分散且多集中于调查类研究, 未来还需 要更多机理性的思考与探讨. 特别是以下个方面, 未 来需要特别关注.
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