1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
干旱、高盐和低温是危害植物生长和影响农作物产量的主要逆境因素。植物为了生存, 在遭遇非生物胁迫时, 必须通过形态及生理生化代谢等方面的调整,以适应或忍耐环境协迫。长期以来，人们一直在培育能在各种逆境条件下生长的经济作物。利用转录因子改良和提高植物的综合抗逆性成为一种很有潜力的方法[1]。nf-y (nuclear factor-y)是异源三聚体转录因子，由nf-ya，nf-yb和nf-yc三种亚基组成，是一种普遍存在于酵母、哺乳动物及植物等真核生物中的转录因子，具有多种生物功能，如参与花期调控、抗逆等[2-4]。转录因子的表达水平受到其启动子的调节。启动子是生物基因中的一个重要组成部分，通常位于结构基因5'端上游长度为2000bp左右的一段序列。
启动子（promoters）就像开关， 控制基因的时空表达，决定基因的活动，它能够与转录因子结合，控制基因的表达与否、表达时间、表达量等；它还能够与rna聚合酶结合和活化rna聚合酶，决定基因的转录起始位点。启动子一般分为广谱表达型启动子、组织特异性启动子、肿瘤特异性启动子等多种形式。基因的启动子部分发生改变（突变），则导致基因表达的调节障碍。这种变化常见于恶性肿瘤。基因工程上常用的35s启动子，包括tata盒子、caat盒子、反向重复序列和增强子核心序列四个部分，被广泛应用于转基因植物中，对它进行改造的许多启动子可以有效提高外源基因的表达水平。同时对该启动子的一些元件进行串联，也可以有效提高外源基因的表达水平。通过对多种基因启动子区的分析发现，绝大多数功能蛋白基因的启动子都具有共同的结构模式，大部分植物基因多数情况下转录起点为a（ 腺嘌呤），且两侧多为嘧啶碱基，在-25~-30bp处含有-tata 序列，-70~-78bp处有caat区出现，-80~-110bp区含有gc盒。习惯上将tata区上游的保守序列称为上游启动子元件（upe），这些特定序列和结构共同作用确保转录精确而有效地起始。
目前研究发现植物基因的启动子含有重要的顺式作用元件，是转录调控的中心。植物启动子包含多种类型的顺式作用元件，其中一些抗逆相关的作用元件通过调控外源基因的表达，使植物在胁迫环境下更具有生命力[5]。启动子中的不同顺式作用元件决定着启动子的功能，一些包含如g-box、abre、myb和myc等调控元件的启动子，他们调控的基因可能参与植物的发育转变、组织分化及胁迫响应等生理生化过程，例如are响应aba，abre依赖于aba。顺式作用元件是与结构基因串联的启动子序列中能与转录因子（反式作用因子）相结合的特定的碱基序列，调控基因转录的精确起始和转录效率。包括启动子、增强子、调控序列和可诱导元件等，它们的作用是参与基因表达的调控。顺式作用元件本身不编码任何蛋白质，仅仅提供一个作用位点，要与反式作用因子相互作用而起作用。通过启动子的功能片段的研究，找出相应的特异性顺式作用元件，对研究基因功能有很重要的帮助。
2. 研究的基本内容和问题
研究目标
油菜是世界四大油料作物之一，属十字花科(cruciferae)芸薹属(brassica)，主要包括甘蓝型油菜(b．napus)、芥菜型油菜(b．juncea)和白菜型油菜(b．rapa)3个栽培种。油菜也是我国最重要的油料作物之一，长江流域油菜产区是我国最大的油菜产区。随着盐土农业概念的提出，沿海滩涂耐盐作物种质的挖掘在最近几年已相继取得一些进展。甘蓝型油菜南盐油1号 是由南京农业大学为能在滩涂上种植而选育出的具有很好耐逆境的油菜品种。通过克隆和研究bnnf-ya9启动子功能区段，为将来油菜的抗逆品种的培育提供一些帮助。
研究内容
3. 研究的方法与方案
DNA的提取：CTAB法（将CTAB放入65℃水浴锅中待用）
1). 用液氮将油菜组织充分研磨后装入1.5ml离心管，立即加入200μl 2*CTAB buffer，涡旋3min后放置在65℃加热仪器上10min；
2). 加入等体积（200μl）氯仿，用力振荡，8000r/min离心3min；
3). 将上清液（约140μl）转移到新的离心管，避免转移含有多糖和CTAB的界面；
4). 加入三倍体积（420μl）的无水乙醇，-20℃放置20min；
5). 8000r/min离心10min，有DNA沉淀，弃上清，将离心管倒置在吸水纸上除去乙醇；
6). 加入50μl TE buffer，溶解DNA，再加入25μl 7.5mol/L醋酸铵，轻敲离心管使液体混匀，再加入75μl异丙醇以沉淀DNA ；
7). 最大速率（14680r/min）离心10min，弃上清，将离心管倒置在吸水纸上除去异丙醇；
8). 加入1ml 70%乙醇，上下颠倒若干次，最大速率离心8min，弃上清，将离心管倒置在吸水纸上（10min）除去乙醇；
9). 加入50μl ddH20，溶解DNA，-20℃保存。
引物的设计：使用Primer Premier 5.0 设计引物。Primer Premier 5.0是用来设计最适合引物的应用软件，利用其高级引物功能，进行引物数据库搜索、巢式引物设计、引物编辑和分析等，可以设计出有高效扩增能力的理想引物，也可以设计出用于扩增长达50 kb 以上的PCR 产物的引物序列。
PCR所需的反应体系与条件
Genomic DNA | 2.0 μl | |||
Forward Primer (10 μM) | 1.0 μl | |||
Reverse Primer (10 μM) | 1.0 μl | |||
2PCR master MIX | 20.0 μl | |||
ddH2O | 16.0 μl | |||
Total volume | 40.0 μl | |||
95℃ | 2 min | |||
95℃ | 30 sec | 30 Cycles | ||
55℃ | 30 sec | |||
72℃ | 2 min | |||
72℃ | 5 min | |||
反应完成后用1%的琼脂糖凝胶进行电泳，回收与预计的目的基因大小一致的电泳条带，然后，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行纯化DNA，将纯化得到的DNA片段连接到pMD19-T vector上，进行测序。然后，将测序得到的序列同数据库中已知的NF-YA9启动子的序列进行比对分析。
转化方法：（从-80℃冰箱取出Trend-T1 感受态细胞于于冰盒上解冻待用）
1).加连接产物于上述50μl Trend-T1 感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴20-30min；
2).42℃热激30S，然后迅速放置在冰上2min；
3).在室温下加入250μl的LB，在200r，37℃摇床中孵育1h，再4000rmp离心1min后弃部分上清，轻弹离心管以混匀悬浮体；
4).取8ul，500mM IPTG和200mg/ml X-gal混合，均匀地涂于准备好的平板上，在37℃培养箱放置30min；
5). 待IPTG，X-gal被吸收后，将3）中菌液均匀涂板，培养过夜。
技术路线见附件
4. 研究创新点
聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction，PCR）是20世纪后期发展起来的一种体外扩增特异DNA 片断的技术，具有快速、简便及高度敏感等优点，能极大地缩短目的基因扩增时间。因此，其一直是生物学者们致力于构建cDNA文库、基因克隆以及表达调控研究的必要前提和基础。近年来，该技术在相关领域得到了广泛应用，并大大推进了分子生物学和相关领域的研究和发展。
本实验将从克隆分析油菜BnNF-YA9的起始密码子上游DNA序列入手，并通过TSSP预测转录起始位点，然后在两种不同的植物顺式作用元件数据库（PLACE和PlantCARE）进行预测分析启动子的包含的调控元件，从而预测BnNF-YA9可能具有的功能，为进一步研究BnNF-YA9提供参考。
5. 研究计划与进展
2016.92016.10 相关文献的阅读与课题的选定；
2016.122017.2 油菜培养及油菜dna的提取；
2017.22017.4 油菜bnnf-ya9启动子不同片段长度的克隆；
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