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1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
课题意义： 近年来，随着我国城市化进程的快速推进，各大城市普遍采取“退二进三”战略进行产业结构和城市布局调整，各地相继出台相关沿江沿海农药企业搬迁的政策。农药作为现今农业发展不可或缺的组成，在防治虫害以及促进农产品生长和发育等方面起着至关重要的作用。农药中使用最多的是人类人工合成的有机农药，而其中有机氯农药曾经占据着很大的比例，后由于其不良影响太大，逐渐被有机磷等新型农药所代替。我国作为有机氯农药的生产和使用大国, 在建国初期曾经工业化生产过六六六、滴滴涕等有机氯农药, 其中使用六六六490万t、滴滴涕40万t, 分别占全球总用量的33和20[1]。2014年中国农药使用量约180.69吨，达到了当年全球农药使用总量的1/2。江苏省农药销售额占据了全国农药销售额的1/3，居全国首位。尽管我国从1983年后就已经逐步禁止生产和使用有机氯农药，但由于其物化特性，之前残留在环境中的部分仍然难以从土壤中根除，植物或其他微生物降解的难度也较大，速度慢，使得我国大部分生产和参与有机氯农药制作和使用的场地中仍然有大量有机氯农药残余，对人们的生活和社会的发展造成了一定的威胁，具有较大的生态安全风险。因而，本研究通过对有机氯农药污染场地土壤进行初步的基因附存情况检测和附存能力调查，为进一步探究有机氯农药降解基因的功能和特征做好准备工作。国内外研究进展：
国内外有机氯农药污染土壤修复现状
有机氯农药在环境中能够通过渗滤、扩散、挥发等途径传播和扩张其污染范围，加大修复治理土壤的难度和成本。因此,要想有效地消除污染,就要尽可能地防止这些过程的进行。目前有机氯农药污染土壤修复方法主要分为三大类，即物理修复、化学修复以及生物修复。但实践表明，传统物理及化学修复技术在处理土壤污染过程中，大多会出现污染物去除不彻底，导致二次污染发生的弊端，从而带来一定程度的环境健康风险危害。生物修复是近年来才发展起来的一门新兴技术,具有成本低、无二次污染及处理效果好等优点,备受人们关注[9]。物理修复与化学修复物理和化学修复主要是通过利用污染物或污染介质的物理或化学性质来破坏（例如，改变化学性质），分离或吸收污染物，具有快速且能处理多种污染物的特点，但同时也存在处理成本高，处理工程量大，清除不完全等问题。较为常见的修复技术有蒸汽浸提修复技术、稳定/固化修复技术、化学淋洗技术等。熊雪丽等通过对选取的16种洗脱剂对六六六和DDT两种复合有机氯农药污染场地进行超声洗脱修复，发现乙酸乙酯和丙酮对HCHs的洗脱率最高；曹梦华等通过以实际农药污染场地为实验对象，发现在最优工艺下，Fenton氧化法对于有机氯农药污染场地土壤中的农药去除率能够达到80以上。生物修复生物修复法又主要分为微生物修复技术、植物修复技术以及微生物-植物联合修复技术等。微生物修复指通过微生物自身的代谢过程将有机氯农药分解转化为无毒或低毒物质，达到修复污染的目的；植物修复则是利用的一些植物的生理需求特性使环境中的有机氯污染物经过吸收、固定和积累等过程富集起来，再进行后续步骤将污染物处理的技术。微生物修复和植物修复技术处理费用较低、清除率较高，缺点则是所需修复时间较长、修复受污染物类型限制等。安凤春等发现用植草的方法研究为DDT及以其为主要污染物的土壤修复技术是可行的，且在植物修复过程中关键在于选择合适的植物品种，与不同种类的草对污染物自身吸收能力的差异关系不大。复合修复技术无论是传统的物理修复技术还是新研究出来的生物修复技术，都有其各自的优缺点。于是综合二者的长处，在修复过程中有使多种修复技术有效的结合，可以达到成本最低，效率最高，处理结果最优的目的。例如，物理修复技术中的电化学动力修复正在逐渐尝试能否与生物修复技术联合治理污染场地；生物修复中的植物修复与微生物修复也能结合使用。对植物根际微域的研究表明,植物与微生物共同配合能明显提高修复的效果。植物-微生物联合修复技术的优势在于可以不对原土壤造成扰动,明显降低了污染物因暴露过程引起二次污染的风险,适用于范围较大的的土壤修复工作。目前,比较成熟的方法是专性微生物与特异性植物相结合的生物修复技术。朱雪梅等的研究表明DDT在根际土壤中的降解略快于非根际土壤, 说明根际环境及根际微生物是植物降解有机污染物的主导场所和因素。2. 研究的基本内容和问题
研究目标：本研究通过查阅文献，找到并合成有机氯农药降解基因引物，通过pcr扩增找出实际污染场地中有机氯农药降解基因，初步探寻污染场地中降解基因的附存情况，以及初步分析可能携带降解基因的土壤微生物。
研究内容：（1）污染场地土壤中微生物dna含量与正常未污染土壤中的dna含量差异；（2）污染场地中是否存在能够降解有机氯农药的基因，其丰度如何。
3. 研究的方法与方案
研究方法：1、 文献资料法：通过大量查找相关文献了解有关实验的信息；2、 实验法：通过设计实验，进行实际操作，利用样本开展小规模试验来反映大尺度的实际情况；3、 定量分析法：通过对实验中数据的定量测定和考量，整理以及比对，得到一定的结果。技术路线：通过对采集回来的不同污染程度土壤进行常温活化和加一定浓度的nacl制成稀释液后，用biolog-eco对土壤中土壤中微生物种类、数量以及遗传物质的量的进行测定,利用不同微孔板中awcd值不同，记录相应对实验数据进行比较和讨论，得出有机氯农药对于微生物生态多样性的各方面影响。
实验方案：1、 有机氯农药污染土壤样品的采集与处理：在江苏省江阴市青阳镇青桐路2号污染场地以及南京农业大学校园每种土壤取大约1kg，存于塑料袋中，运至实验室后，置于4℃冰箱保存备用。土壤采样方法按照多点混合采样法，按田字型五点样混合而成，取样土层为表层0-20cm,土样剔除植物根系、石块并混合均匀。2、有机氯农药降解基因引物的合成：通过查阅文献找到了几种降解有机氯农药的基因，并从中选取了7种基因作为本次实验的参考基因。将引物序列送至引物合成公司金斯瑞（genscript），得到了所需的含有降解基因的dna合成引物。
3.pcr所需酶体系配制pcr扩增所需酶体系总共为50μl，样品体系为25μlex taq酶 0.5μl前引物 0.5μl后引物 1μldna模板 23μl无菌水，阴性对照则不加dna模板，换为1μl无菌水。本次实验总共有7种降解基因引物，加上16sdna总共8种样，每种分别对应6中土壤样品和一组阴性对照，故总共有56个样。 配制酶体系时由于每种样的需要加的试剂除了阴性对照组不加dna模板外，其余六种土样加的酶、引物以及无菌水的量是一样的，故将前三者加入2ml管后，分别加入dna模板和无菌水即可，如此配好56个样，在管上标明降解基因种类以及土样编号。以下操作均在超净台中完成。将样品放入冰箱中-20℃保存，准备pcr扩增。4.琼脂糖凝胶配制取两个200ml锥形瓶，分别称取2g琼脂糖和100ml去离子水，稍微摇晃均匀后，放入烤箱中加热至溶液中琼脂糖溶解完全，溶液澄清后向其中加入5μlwar-red染色剂，再将锥形瓶放回烤箱中加热约10s后取出，冷却至不再烫手后即可将胶均匀倒入胶板上，等胶干后取出梳齿，放入缓冲液中赶走气泡后，即可点样。
4. 研究创新点
当前国内外对于有机氯农药降解基因的研究还较少，大部分还只是停留在较宏观的科研
5. 研究计划与进展
2019.02-2019.03：阅读相关文献，确定课题；2019.03：采集污染厂地土壤样本并进行相应的处理和土壤理化性质分析；2019.03-2019.04：进行DNA提取、PCR扩增等实验；2019.04-2019.05：对实验数据图像进行整理分析比较，得出实验结论；2019.05：撰写论文。
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