吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007突变体文库的构建及抗病相关基因的克隆开题报告

1. 研究目的与意义

生物防治是国内外植物病害防治的重要手段和发展方向，应用植物的有益内生细菌用导日来提高植株的抗病能力已成为目前植物病害生物防治的研究热点。本实验室从杨树体内筛选出一株内生细菌，并鉴定命名为吡咯伯克霍尔德氏菌(Burkholoeriaprrocinia)JK-SH007,已证明其是一株具有抗病、促进生长、解磷功能的生防细茵，已经取得了较好的防治效果。并开展了该菌株的定殖、促机理、安全性和发酵优化等与生防相关的研究。但对其抗病的分子机理研究还不完善。因此，本研究运用分子生物学的方法，采用随机插入转座子的方式，构建突变体吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH0O7突变休文库，筛选并克隆相关抗病基因。为进一步阐明生防菌JK-SH007定值机制、抗病的分子机理奠定一定的基础，并为后续的实验提供材料。

2. 国内外研究现状分析

国内外有关吡洛伯克霍尔德氏菌(burkholoeriaprrocinia)jk-sh007的研究比较少并且国内近几年才开始研究。

2010至今年， 我国科研人员对jk-sh007进行了很多理化研究，包括对菌株抗菌蛋白的初步研究；吡咯伯克霍尔德氏菌 jk-sh007 对杨树根际微生物数量及功能多样性的影响的实验，进一步证明该菌株的生物安全性，为将来该菌株的野外应用及生防菌剂的开发奠定基础。和对jk-sh007 高 gc 基因 pcＲ 体系的扩增的研究，为洋葱伯克霍尔德氏菌群菌株及其他菌株高 gc 含量基因的克隆提供了参考依据。

在2014年，刘好桔等人对洋葱伯克霍尔德菌t1828和zwl15-tn5转座子插入突变体库的构建及相关突变体的筛选初探，实验采用双亲结合法将含有tn5转座子的质粒prll063a导入洋葱伯克霍尔德菌t1828和zwl15中,在含有卡那霉素和链霉素的抗性平板上筛选抗性接合子。通过随机插入诱变后,共获得300个突变株。pcr检测随机挑选证明其中6株突变株均已被tn5插入染色体基因组且丧失冠毒素合成的能力。本研究为今后转座子插入位点侧翼序列的克隆与测序,并进行功能回复试验提供了基础。目前，科研人员对水稻黄单胞杆菌病理研究已有很多进步，本实验可以借鉴，利用限制性内切酶随机插入突变体文库对相关抗病突变体的进行鉴定筛选的方法。

3. 研究的基本内容与计划

1、2017.12.252018.2.5 查阅文献，进行预实验试验，构建随机整合载体。

2、2018.2.62018.3.6 吡咯伯克霍尔德氏菌jk-sh007突变体文库的构建

3、2018.3.16－2018.4.25 随机插入突变体的筛选与验证

4. 研究创新点

本实验的创新之处在于构建出吡咯伯克霍尔德氏菌的突变体文库后，用PCR等相关技术筛选出杨树溃疡病抗病基因并进行克隆。