松材线虫环状RNA的鉴定与功能初探开题报告

1. 研究目的与意义

松材线虫病是一种病原主导性的病害，又称松树萎蔫病，在较短的时间内就能导致松树的死亡，是一种松树上的毁灭性病害。该病害主要危害松属植物，包括黑松、赤松和马尾松等，也对少数非松属针叶树有影响，如红云杉、黑云杉^[1]。

1905年，在日本长崎市第一次报道了该病引起松树的大面积枯死，随后扩散至整个国家，使得日本松树资源和经济受到了巨大的损失^[2]。1982年，在我国南京中山陵首次发现该病。在短短30年，已扩大到江苏、安徽、广东、浙江、山东、福建、江西、广西、四川等16个省，每年发生面积近10万hm²，累计致死松树达5 000多万株，直接经济损失25亿元，间接损失250亿元。近年来疫情扩散蔓延呈加剧之势，对我国大面积的松林构成了严重威胁，成为我国最具危险性的头号森林病害^[3]。

环状rna（circrna）是一种不含3′端结构的rna。在1970年，首次在病毒中发现circrna^[4]。1993 年在小鼠睾丸中发现由性别决定基因sry转录而来的circrna。2006年又在果蝇中发现来自于盲肌的未知环状rna。2012 年，salzman等利用rna-seq方法研究癌症相关的染色体重排或基因融合，环状rna不但在癌细胞样本中存在，而且在人正常细胞系、小鼠脑组织中也大量存在，在细胞中的总量约占线性rna的1%，部分环状rna的丰度超过了对应等位基因位点的线性rna^[5,6]。近年来，随着高通量测序技术的进步和相应的序列比对算法的优化，circrna得到更加全面和深入的研究，被发现广泛的存在于包括人、小鼠和线虫等在内的真核生物界，且越来越多的证据表明，circrna是一类功能性的生物大分子，具有多种生物学功能^[7]。目前，circrna在动物中的研究相对深入，数个基因的作用机制已得到解析;而circrna在植物中的研究还相对较浅，主要集中在circrna鉴定及功能预测方面，尚缺乏深入的功能研究。

2. 国内外研究现状分析

1 松材线虫病概述

1.1松材线虫概述

松材线虫病病原为松材线虫（bursaphelenchus xylophilu），属于动物界，线虫门，侧尾腺口纲（secernentea），滑刃目（aphelenchida），滑刃亚目（aphelenchina）,滑刃总科（aphelenchoidoidea）滑刃科（aphelenchoidoidae），伞滑刃属（bursaphelenchus）^[11]。

3. 研究的基本内容与计划

1 研究内容

以松材线虫作为研究对象，通过高通量测序结合生物信息学软件预测的方法对其可能含有的circrna进行初步预测。在预测结果的基础上，利用传统分子生物学技术进行验证。明确松材线虫circrna的存在可能，探索其在不同种群或不同发育阶段的松材线虫中是否存在着差异性表达。

2 研究方法

4. 研究创新点

松材线虫的分子研究早已开展，而随着松材线虫基因组的公布，更是开启了松材线虫分子生物学研究的新时代。近年来，基于高通量测序的松材线虫转录组miRNA、转录组、SNV、蛋白组等研究相继发表^[8,9,10]，对这一病害的相关研究都有着很好的借鉴作用。但是，关于松材线虫体内是否存在circRNA并未有相关的报道。而环形RNA具有重要的基因调控功能，了解松材线虫circRNA的功能对于我们阐明该病害的致病机理提供了新的研究方向。因此，本研究在松材线虫转录组测序工作已经完成的基础上，利用转录组序列进行候选circRNA的筛选。利用PCR技术对预测的结果进行实验验证，以期获得真实可靠的circRNA序列。通过对不同毒力松材线虫样本中circRNA的表达差异进行qPCR实验分析，探究circRNA在松材线虫体内可能发挥的调控作用。