基于叶绿体基因组信息的柳属进化分析开题报告

1. 研究目的与意义

杨柳科属间分类和进化一直受到争议，争议的焦点是杨柳科有几个属（2-4个），各个属之间的关系如何界定。形态学和花粉学证据表明钻天柳，心叶柳和大风子科部分物种规划到杨柳科。近年来，利用叶绿体基因组和核基因组等分子数据产生很多有意思的发现，但距离杨柳科实际分类还有一些距离。随着高通量基因组测序技术的发展，利用叶绿体全基因组信息进行柳属分类和进化具有重要的意义。

论文将采用第二代高通量测序技术，对柳属三蕊柳，簸箕柳，筐柳，沙柳等柳树叶绿体基因组测序，同时结合数据库信息，分析柳属进化规律，为杨柳科各属进化提供重要的参考。植物全基因组测序是进行基因功能解析、 研究基因表达调控和开展基因图位克隆的重要研究平台。 毛果杨全基因组测序组装的完成使柳树成为木本植物研究的模式树种。 但是柳树世代周期长， 一般 6~7 年才能开花， 且个体高大， 作为木本植物的模式仍存在明显缺陷。 而簸箕柳是原产我国的当年开花小灌木， 是柳树的姊妹种， 其个体小、 更易于无性繁殖， 容易开展大规模田间实验， 且存在丰富的自然变异， 是木本植物遗传研究的理想材料。柳树因其生长速度快、 适应性强、 基因组相对较小(约为 550Mb)、 易于种间杂交和无性繁殖等优点， 而被选作木本植物的模式树种。 经过多年的研究， 构建了大量的遗传连锁图并获得大量与目标性状相关的分子标记， 同时也建立完善的遗传转化系统。 2006 年毛果杨全基因组序列的发表， 为通过正向遗传学手段克隆木本植物未知基因提供可能。 但是由于柳树世代周期长， 开花期也要 6~7 年以上， 且柳树个体高大， 难以开展大规模的田间实验， 和模式植物拟南芥相比， 柳树作为木本植物的模式仍存在明显缺陷。簸箕柳是柳树的姊妹种， 是原产我国的当年开花小灌木， 个体小且幼龄期短， 易于开展大规模田间实验， 且存在丰富的自然变异， 是理想的遗传学研究材料。 比较基因组发现柳树和柳树起源于共同的古四倍体祖先， 利用高度保守的分子标记可以构建杨柳科植物的宏基因组研究平台， 因此可用簸箕柳作为研究材料快速克隆重要性状基因， 然后在柳树中开展同源基因克隆， 为开展柳树分子育种创造条件。 然而和柳树相比， 簸箕柳分子生物学研究相对落后。 植物全基因组测序是基因功能解析、 基因表达调控和进行基因图位克隆的重要研究平台。 随着第二代测序技术的日臻成熟， 使测序成本大量降低， 因此开展了簸箕柳的全基因组测序， 结合已经构建的测序个体作图群体的高密度遗传图谱， 完成簸箕柳遗传克隆平台的构建重要依据， 后期将开展柳属进化体系的研究， 有望将柳属开发成为木本植物功能基因组研究的模式树种。

2. 国内外研究现状分析

1.1叶绿体基因组的起源与发展

叶绿体的起源存在多种假说，但最普遍为人们所认可的是＂内共生起源＂学说，该学说认为叶绿体源于原始真核细胞内共生的蓝藻。真核细胞的直接祖先为一种不需氧的且具有吞懂能力的古核生物，其生命活动所需的能量来源主要为其自身所吞隨的糖类物质。其中部分物种在吞隨真细菌的同时，伴随吞隨了某种原始的蓝藻，蓝藻在宿主细胞内未被消化而逐步与宿主细胞形成了互利共生关系，在长期的演化过程中演变成为宿主细胞内的行使光合作用而发挥自养功能的细胞器官一叶绿体。叶绿体保留的一些其祖先的基本特征和痕迹，为＂内共生起源＂学说提供了大量证据。近几十年来，随着大规模测序技术的不断发展Ｗ及序列拼接技术的不断完善和叶绿体基因姐研究的不断深入，人们对叶绿体基因组的关注度明显升高，叶绿体全基因组序列测定数目急剧增加。随着地钱（Ｏｈｙａｍａｅｔａｌ．，巧８６）和烟草（Ｍｃｏ打ａｎａ口／ａｔｏ）（Ｓｈｉｎｏｚａｋｉｅｔａｌ．，１９８６）等叶绿体基因组测序的完成，迄今已积累有水稻（Ｏ／ｊｚａｓａｆｔｖａ）（Ｃｕｉ，２００６）、文屯、兰（Ｏｗｅ诚Ｍ７Ｍ）（Ｗｕ，２０１０）、大豆（ＧｆｙｃＺ＂ｅｗａｘ）（Ｓａｓｋｉ，２００５）、高山南芥ａ斬打口）（ＣｈｒｉｓｔｅｌｌｅＭｅｌｏｄｅｌｉｍａａｎｄＳｔ合ｐｈａｎｅＬｏｂｒｅａｕｘ，２０１３）、水蕴草（￡７〇庇幻ｃａ乃幻成内ｓｉｓ）（ＨｕｏｔａｒｉａｎｄＫｏｒｐｅｌａｉｎｅｎ，２０１２）、窝宦（王ａｃ化ｃａｓａｆｔＶａ）（Ｒｕｔｈｅｔａｌ．，２００７）等较为丰富的真叶植物叶绿体基因组全序列数据。截至２０１７年３月，ＮＣＢＩ中已经公布的陆生植物叶绿体基因组数据达到１１５７条，其中２０１０年来测定的序列数目占８９％Ｗ上（图１．１）。测序技术的发展和叶绿体基因姐生物信息学分析技术的成熟，使得叶绿体基因组序列数量迅速增加，叶绿体基因组的研究也随着叶绿体基因组数目的増加得到了迅速发展，尤其是对农作物等陆生植物的叶绿体结构变异等方面的研究有了更进一步加深[5]。

1.2叶绿体基因组硏究进展叶绿体是绿色植物中进行光合作用的细胞器，在真核自养生物尤其是陆生植物和藻类植物中普遍存在。除了进行光合作用外，叶绿体在植物细胞内还参与淀粉、氨基酸、脂肪酸、色素及维生素的生物合成，Ｗ及硫酸盐还原作用和氮循环等各种生化反应（Ｂａｕｓｈｅｒｅｔａｌ．，２００６；ＪａｒｖｉｓａｎｄＳｏｉｌ，２００１；Ｌｅｉｓｔｅｒ，２０的;ＮｅｕｈａｕｓａｎｄＥｒｎｅｓ，２０００），为生物的进化提供源动力。作为光合作用的中也，叶绿体具有完整的遗传系统，其中的遗传物质则为叶绿体基因组。对叶绿体基因组进行研究将有利于揭示植物光合作用的机制及代谢调控途径。叶绿体基因组具有不进行重沮和单性遗传的特点，因此常被作为植物系统进化分析中重要的遗传标记（Ｐｒｏｖａｎｅｔａｌ．，２００１；Ｒａｕｂｅｓｏｎ，２００７）。叶绿体作为一个半自主型细胞器，其中具有功能的多数蛋白质依赖于细胞核基因编码供给，因此，叶绿体基因组的深入研究有助于理解细胞核基因组与叶绿体基因组之间的相互调节作用。分子生物学和基因组学的日益发展为植物叶绿体的研究提供了有利条件，叶绿体基因组的深入探讨也为植物分类、系统发育化及物种鉴定等方面提供了重要的遗传信息。1977 年 sanger 等发明的双脱氧链终止法和 maxam 等人发明的传统化学降解法开创了基因组测序的先河。 双脱氧链终止法又称为 sanger 法， 和化学降解法相比具有操作简单、速度快、 准确性高等特点， 而成为第一代测序技术的经典测序方法。 该方法在 dna 合成过程加入带有荧光标记的 dntp 不能形成磷酸二酯键， 因此每次只能合成一个碱基， 然后采用高分辨率的凝胶电泳和放射自显影来确定合成的碱基序列。 美国应用生物系统公司对上述测序技术进行改进， 应用四种不同颜色的荧光染料标记不同的 dntp， 通过单引物pcr 反应， 合成 3'末端只差一个碱基的 dna 片段混合产物， 并通过毛细管电泳检测荧光信号而实现了测序的自动化， 大大降低了测序时间和操作的难度。 正是基于该技术加快了测序进度， 而缩短了人类基因组计划完成的时间。 之后模式植物拟南芥和水稻也都采用了第一代测序技术完成了全基因组测序[3]。

3. 研究的基本内容与计划

柳属植物基因组研究进展

2.1柳树是我国优良的经济树种之一。柳树种质资源丰富,生长快,抗逆性强,适应范围广,形态美。柳树既可生产木材和其他林副产品,又能改善生态环境,绿化美化城市景观,是集经济价值、生态价值和观赏价值于一体的优质树种。虽然大多数柳树可以通过扦插进行繁殖,但仍存在一些扦插不易成活的种类;一些用于大规模生产的柳属植物枝条少,扦插数量有限,扦插方式难以达到生产需求。而植物微体快繁技术具有繁殖系数高、繁殖周期短、繁殖速度快的特点,对柳属植物生物学研究具有重要的理论意义,且组培苗移栽不受季节的限制,有利于其规模化生产。植物的系统分类与起源演化、形态特征与生态特性、生理机制与细胞遗传、造林技术与生物防治以及药理作用与植物化学等研究进展进行综述,展望其未来研究前景。

2.2杨属和柳属是杨柳科的姐妹属,一般以二倍体形式存在。以前基因组的研究表明杨属和柳属起源于同一个古四倍体祖先。在本研究中,我们首次对簸箕柳的染色体进行了组装。在染色体的水平上,分别对毛果杨和簸箕柳进行基因组内的比较分析,结果显示在两个基因组中,每条染色体在基因组的其它位置上都有同源片段的存在,而且同源片段的分布情况非常相似,这一结果不仅证实了同一起源的说法,还表明两个物种的分化发生在古四倍体祖先重新二倍化之后。除此之外,1号和16号染色体同源片段的分布在两个基因组间差异较大。经过杨树和柳树基因组间的比较分析,发现在1号和16号染色体间出现了两个大的染色体重排。杨树1号染色体的上半部分与柳树的16号染色体同源,而杨树的16号染色体与柳树的1号染色体的上半部分同源。这说明在杨树和柳树这两个物种形成过程中,1号和16号染色体间发生了断裂融合。以前通过杨、柳形态学上的研究认为杨树较柳树原始,柳树是由杨树进化形成的。在此基础上,我们提出了杨柳科植物进化的模型:杨柳科植物的祖先基因组在距今约5,800万年前发生了一次杨柳科植物特有的全基因组复制事件(salicoidduplication)。全基因组复制以后,古四倍体基因组又发生了染色体的断裂与融合,基因组进行了重新二倍化,首先形成了现代杨树的祖先。在随后的进化过程中,杨树的1号染色体发生了着丝粒断裂,其下半部分与16号染色体的端粒进行融合形成了柳树的1号染色体,而其上半部分进化形成了柳树的16号染色体。经过这一染色体重排事件,诞生了现代柳树的祖先。本研究为揭示高等植物在全基因组复制之后近缘物种的分化机制的研究奠定了基础。另外,杨属和柳属是雌雄异株植物,是研究植物性染色体进化的理想材料。以前的研究证明:在杨属中,19号染色体进化成了性染色体。而本研究通过对性别基因的定位发现柳属植物的性染色体是由15号染色体进化形成的。杨属植物中存在zz/zw和xx/xy两种性别决定系统。而柳属中的簸箕柳的性别决定系统为zz/zw,在雌性个体有2条不同的性染色体。将毛果杨的15号常染色体和19号性染色体分别与簸箕柳的15号性染色体和19号常染色体进行共线性分析,结果显示杨树的19号性染色体与柳树的19号常染色体同源,柳树的15号性染色体与杨树的15号常染色体同源,并且柳树的两条性染色体出现了染色体重排,而杨树的19号性染色体与柳树的15号性染色体间没有同源性。由于柳树和杨树起源于同一个祖先进化而来的,因此,我们推测杨、柳性染色体的形成发生在物种分化之后,是由不同的常染色体进化而来的。本研究揭示了杨柳性染色体的进化机制,为雌雄异株植物性染色体的进化研究奠定了基础。

4. 研究创新点

观察叶绿体基因组信息结构特征，对柳属进化分析，采取有关生物学理论知识以及科学依据，开展此次研究内容。为以后的学术研究提供重要依据。主要方法有：

（1）规范研究方法：综合分析法、归纳总结法

（2）文献考证方法：将锁借阅的文献整理研究,得出结论.