基于重组酶介导等温扩增-侧流层析技术冬生疫霉检测方法的建立开题报告

1. 研究目的与意义

冬生疫霉是疫霉属中侵染柑橘引起的疫病造成严重病害，首次发现于澳大利亚西部柑橘果实上，随后在美国、法国等国家相继出现。目前还未在我国发现，是我国植物检疫中重点防范的检疫性病菌。它不仅危害柑橘，还能对番茄、苹果、葡萄、芝麻等其他橘类植物产生危害。常规的检测方法是根据病原菌形态、生物学特征的差异进行鉴别。近几年分子检测技术兴起，国内外学者对冬生疫霉采用普通PCR和实时荧光PCR技术检测，虽然实时荧光PCR相较于普通PCR，灵敏度高特异性强，但是其设备昂贵，操作复杂，需要专业人士，不利于现场检测和口岸检疫。而建立的RPA（Recombinase Polymerase Amplification）检测方法，操作简便，不需要精密仪器，只需要一个恒温水浴锅或金属浴，采用RPA试剂盒，结合凝胶电泳或者试纸条，在20分钟内就能得出检测结果，灵敏度更高，特异性更好，为口岸检疫和现场检测该病菌提供更加稳定高效的检测方法。

2. 国内外研究现状分析

该菌是柑橘果实褐腐病的主要病原之一，在柑橘采收前后均可造成严重的经济损失，尤其是在雨季。柑橘果实、叶片、小枝都可被侵染，可导致果实褐腐，叶部和小枝 枯 萎。受 侵 染 果 实 味 苦，具 腐 臭 味。果 实受害，损失可达７５％。橘早熟品种尤易感病，不同种类柑橘作物受侵染程度不同，柑、橘的叶、果均受侵染，

疫霉菌的形态和生物学性状易随环境及寄主而表现较大的变异性，而且要获得分离培养物需要较长时间，传统的症状观察及形态学方法无法满足口岸检疫便捷准确的需要。近年来，分子生物学技术的快速发展，为疫霉菌的快速检测提供了有力的支持。目前在柑橘属疫霉菌检测中主要包括免疫学技术和核酸技术两大方面。分子检测方法特别是 PCR 技术的发展使得病原菌实现了快速、准确、灵敏的检测，因而也被广泛应用于疫霉菌的检测当中。近年来，分子生物学方法广泛应用，已成为实验室检测最常用的手段，主要包括常规 PCR、巢式 PCR、多重 PCR、实时荧光 PCR（Real-Time PCR）和 LAMP 技术等。

3. 研究的基本内容与计划

（1）冬生疫霉基因组dna的提取；

（2）特异性靶标的发掘及其引物筛选和重组酶介导等温扩增(recombinase polymerase amlification，rpa)技术实验引物探针设计；

（3）应用侧流层析试纸条进行扩增产物检测。以dna为模板，进行rpa扩增，向装有检测干粉的反应单元管中加入缓冲液buffer 29.5μl，10μm的上游引物2.1μl，10μm的下游引物2.1μl，探针0.6μl，dna 2.0μl；mgac2.5μl加在八连管的盖子上，共计50μl扩增体系，小心翻转盖上，将rpa扩增体系充分混匀，5,000g离心10s，置于39℃金属浴上反应30min，温育4分钟后拿出反应管再次混匀，离心3-5秒，放入水浴锅继续反应30min。当试纸条出现两条棕色条带，一条位于质控区内，一条位于检测区，则结果为阳性，表明样本中含有大豆疫霉；当试纸条只有质控区出现一条棕色条带，检测区没有条带，则结果是阴性，表明样本中不含有大豆疫霉。

4. 研究创新点

重组酶聚合酶扩增技术 （Recombinase Poly鄄merase Amplification，简称 RPA）是由国剑桥 Babra鄄ham 研究院成立的 TwistDx 生物技术公司发明的一种体外核酸等温扩增检测新技术，既可以检测 DNA， 也可以检测 RNA。操作简便，不需要精密仪器，只需要一个恒温水浴锅或金属浴，采用RPA试剂盒，结合凝胶电泳或者试纸条，在20分钟内就能得出检测结果，灵敏度更高，特异性更好，为口岸检疫和现场检测该病菌提供更加稳定高效的检测方法。

由于与聚合酶链式反应（PCR）技术相比较，具有成本低、耗时短、操作简单、不受检测场地限制等优点，因此 RPA 技术被认为是可以替代 PCR 的核酸检测技术而受到广泛关注，成为分子检测技术研究的热点之一。