植物根际微生物生物膜共培养与组成分析开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

研究意义：

自19世纪末开启微生物的研究以来，科学家对微生物世界的理解一直局限于纯培养，2005年高通量测序技术的发展逐步揭示了复杂的微生物多样性^[1]，微生物的研究自此进入微生物组时代，可培养微生物的研究也需要从纯培养转变为多菌共培养，才能进一步理解复杂的微生物世界^[2]。植物“全功能体（holobiont）”不仅包含植物自身，还包含相关微生物，包括叶际微生物、根际微生物、根内微生物等，它们对宿主的生长和健康非常重要^[3-4]，然而复杂的群落组成使研究微生物组与植物的互作十分困难，关于微生物群落的组装，动态过程，抗逆性产生的原因等方面的研究还不清晰。要深入了解微生物组，就需要人工重建一个简化、具有代表性的、在实验室条件下可控的合成微生物群落。

许多研究已经建立起了简化微生物群落与宿主互作的模型。关于植物领域合成菌群的文章是julia vorholt教授组在2014年在plos genetics上发表的文章，相关研究将简化的细菌群落模型接种植物拟南芥的叶片，以表征植物基因如何影响叶际菌群形成^[5]。植物微生物组领域专家jeffery dangl课题组于2015年在science上发表论文，利用38株细菌组成合成菌群，研究了植物免疫系统对根系微生物群落建立的影响，发现水杨酸能调控特定细菌类群的组装^[6]。

2. 研究的基本内容和问题

研究目标：

实验室前期从黄瓜根际分离到六个菌株，在已有的研究基础上，进一步探究不同组合下的生物膜在不同培养环境下，其生物膜增量、表型及其组分含量的变化。

附六个菌种（以下均使用简称）：

研究内容：

1、研究不同菌种组合下生物膜形成效果；

2、生物膜表型变化的记录；

3、对生物膜量的变化进行测定，包括多种方法的选择和结果的对比；

拟解决的关键问题：

1、能够明显增强或减弱生物膜量的组合的选择；

2、对于不同菌种组合生长环境的确定；

3. 研究的方法与方案

1、研究方法、技术路线、实验方案

1.1 研究方法

本研究通过查阅相关资料，确定实验方案后，针对6个菌的单菌生物膜表型进行研究，在确定其生物膜生成量及相关条件后，利用软件进行分析并确定预实验的组合方案。在确定各组合方案后，进行多菌培养，并进行生物膜量的测定，根据生物膜量的情况，决定后续实验。

1.2 技术路线

1.3 实验方案

1.3.1生物膜样品的收集和称重

单菌生物膜表型观察及测定：6株纯化的菌株单独过夜活化，调OD₆₀₀=1，按1%的接种量添加到6孔板中，板中放置100 μm细胞过滤器用于收集生物膜。TSB、Msgg培养基30℃分别培养24h、30h，分别收集生物膜和培养液。在超净台中将细胞过滤器风干进行称重，确定生物膜重量。

生物膜共培养表型观察及测定：组合内的菌株过夜活化，调OD₆₀₀=1，按1%的接种量单独或混合（1：1）添加到6孔板中，板中放置100 μm细胞过滤器用于收集生物膜。TSB、Msgg培养基30℃分别培养24h、30h。分别收集生物膜和培养液。在超净台中将细胞过滤器风干进行称重，确定生物膜重量。

1.3.2 多菌组合设计

经过查阅文献及利用相关软件进行分析，决定以Pan和Chry两菌为核心，设计如下组合进行实验：

数据处理和作图使用Excel 2019，Gephi，Graphpad Prism 8，Adobe Illustrater CC 2019。

2、可行性分析：

本实验室长期从事根际微生物相关研究，其中徐志辉副教授、孙新丽博士等长期进行生物膜相关实验和研究，成果显著。本次实验中涉及的多个菌种如Pantoea eucrina 、Pseudomonas stutzeri 在世界范围内广泛研究，关于其生物膜的相关研究众多，方法各异。基于此，本研究期望通过研究生物膜量的变化来揭示多菌互作之间的相互关系，促进多菌微生物的相关研究。

4. 研究创新点

当前在土壤根际促生菌的研究中，实验室条件下的研究主要以单菌纯培养模式为主，还未较多研究多菌株的组合。本研究尝试组装不同菌种，装配多菌微生物组合，提高生物膜产量，为以后的研究提供材料和理论基础，促进多菌微生物的研究。

5. 研究计划与进展

2019.9-2019.10 阅读相关文献，完善实验方案，落实细节；

2019.10-2019.11 对6个菌种进行纯化、纯培养并进行菌种保藏；

2019.11-2020.1 确定试验方案，并对不同的组合进行预实验，确定最终组合和培养环境；