OsPIN9参与氮素形态调控对水稻分蘖发育的影响开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

生长素是非常重要的植物激素。生长素输出载体蛋白在调节植物生长素极性运输中起重要作用。生长素极性运输参与胚胎形态发生和侧生器官的形成。拟南芥基因组中的 PIN 基因家族编码 PIN1-8 的 8 种生长素输出载体蛋白(Friml et al., 2003; Benjamins Scheres, 2008)。PIN 蛋白可以通过内吞作用转运到细胞质中，并形成循环小泡返回质膜(Geldner et al., 2001)。AtPIN1 突变体植株表现出针状花序并且花和维管组织发育表现明显缺陷(Galweiler et al., 1998)。AtPIN1 的极性定位还影响胚胎的发育(Friml et al., 2003)。AtPIN1 分布于维管组织(Galweiler et al., 1998)，木质部薄壁组织(Glweiler et al., 1998; Palme Galweiler, 1999)，根表皮，皮层细胞(Blilou et al., 2005)，分生组织表皮和原基表皮 (Guenot et al., 2012)的细胞质中。近年来，遗传、分子和药理学等方面的研究已经表明，生长素作用于植物生长和发育的各个方面。生长素参与调控根系形成、花序和叶序发育、维管组织分化、顶端优势、果实成熟以及向光性和向重性等植物的生长发育和形态建成过程。生长素在植物面对生物胁迫及非生物胁迫时起着重要的作用。生长素主要在生命力旺盛的组织中合成，如发育的种子、根尖分生组织、茎分生组织、幼叶等，然后运输到作用的部位。在高等植物中，生长素存在2种截然不同的运输方式：（1）依赖于自由扩散的维管系统运输，运输方向取决于两端浓度差等因素，是一种长距离的运输[1]；(2)耗能并需要 运 输 载 体 的 运 输，是 一 种 短 程 的 主 动运输[2]。主动运输对生长素不对称分布起着关键作用，又称为生长素极性运输。根据生长素运输方向分为向基运输和向顶运输。植物根中同时存在这2条运输途径：一条是向顶运输，即生长素在地上部合成后运往根尖；另一条是向基运输，即将生长素从根尖运输到根茎连接处。植物地上部中只存在向基运输，即生长素在叶尖合成后向根茎结合部运输。对于生长素极性运输的机制研究，Raven提出细胞内外的PH值和电势差对生长素的运输具有决定 作 用，在 此 基 础 上 形 成 了 化 学 渗 透 偶 联 模 型。生长素是一种弱酸，在细胞质生长素解离为阴离子状态，较难透过质膜，由不对称分布在质膜上的运输载体转运出细胞，从而实现生长素的极性运输[3]。极性运输是生长素特有的运输方式，依靠特定的载体来完成。生长素极性运输依赖3种运输蛋白：输入载体 AUX/LAX家族、输出载体 PIN家族和兼有输入和 输 出 功 能 的 ABCB/MDR/PGP家族。

PIN家族是目前研究最多且最深入的一类生长素输出载体。AtPIN1是PIN家族第1个克隆到的基因，atpin1表现出花序发育缺陷，形成针状花序，没有茎生叶和花器官，生长素在茎中的向基运输能力减弱[4]。先后人们从拟南芥中分离到了8个PIN蛋白家族成员。在结构上，PIN蛋白是一类由2个疏水区和1个亲水区构成的膜内在蛋白，2个疏水区均由5个跨膜螺旋结构。亲水区结构可分为2类：(1)由C1和V1结构构成较短的亲水区；(2)由C1、C2、C3和 V1、V2结构构成较长的亲水区域。研究表明，亲水区对PIN蛋白的定位和调控功能有着重要的作用。在V2区和C端疏水区之间有1个NPXXY保守结构，在亲水区还有糖基化和磷酸化位点，对PINS翻译后修饰起重要作用[5]。AtPIN2定位于根和茎的中柱细胞及维管组织的细胞基部，负责茎中生长素的向基式运输和根中的向顶式运输[6]，突变体表现出针状花序，同时侧生器官也发育异常。AtPIN2定位于根皮层细胞，根冠细胞顶部，且极性分布在伸长区表皮细胞基部，负责根中生长素的向基运输，AtPIN2表现出根向重性减弱和侧根延伸迟缓[7]。AtPIN3侧向分布于根的中柱、中柱鞘细胞及茎的内皮层，介导生长素在重力反应和向光性的侧向分布，AtPIN3对光和重力性反应降低，并且生长缓慢[8]。AtPIN4分布于根尖静止中心细胞及下方的一些细胞中，维持静止中心下方生长素库浓度具有重要功能，AtPIN4参与维持根尖分生组织的发育模式[9]。在胚发育的1细胞期至16细胞期，AtPIN7极性分布于胚柄细胞质膜的顶部，在16/32细胞期，AtPIN7的定位发生逆转而定位于胚柄细胞质膜的底部。AtPIN7对于胚轴的形成和根中生长素的向顶运输有着重要功能[10]。AtPIN5、AtPIN6、AtPIN8的疏水区较短，3个蛋白都定位于内质网中，负责生长素在细胞质和内质网的运输，调节细胞内的生长素平衡[11]。AtPIN5表现出侧根发生缺陷、主根和下胚轴变短。启动子：：ＧＵＳ表达分析显示，AtPIN6在原分生组织中表达，暗示 AtPIN6参与组织或器官的分化，但PIN6在并没有明显的表型[12]。AtPIN8在拟南芥雄性配子中表达，对于花粉的发育起至关重要的作用。虽然AtPIN家族成员有着各自的定位及功能，但它们在某一特定的生长过程中起着协同的功能，如 AtPIN1、AtPIN2、AtPIN3、AtPIN4 和AtPIN7协同调控根系的发育。AtPIN1负责生长素在根中的向顶式运输，生长素在根尖处积累，形成生长素 库，由 AtPIN4 重 新 分 配，生 长 素 通 过AtPIN2在表皮和皮层中进行反流的向基运输，在伸长区AtPIN1、AtPIN2和AtPIN7介导生长素侧向分布或回流到中柱，从而形成回流环路，保持静止中心端的生长素浓度最大值。PIN蛋白的活性影响植物各部位的生长素浓度，从而影响植物生长发育过程。近年来的研究表明，PIN 蛋白的活性调节机制可分为4类：基因表达调控、磷酸化调控、极性定位调控和生长素运输抑制剂调控。除生长素外，油菜素内酯、乙烯、赤霉素、细胞分裂素以及黄酮类物质都能影响PIN基因的转录。PIN 蛋 白 的 亲 水 区 存 在 着 磷 酸 化 位 点。PIN的极性定位可被丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶调控，而PIN是受激酶PDK1的磷酸化调控，这表明磷酸化调节PIN蛋白的极性定位。GNOM基因与真菌毒素布雷菲尔德菌A都通过影响囊泡运输而影响PIN蛋白的分布。固醇类物质对AtPIN2的极性分布至关重要，CPI1-1突变体中，固醇的组成发生改变，可能影响了AtPIN2的内吞作用和根的向重性反应发生改变：野生型中AtPIN2蛋白首先定位在膜两极，然后在某一极消失，而CPI1-1中PIN2始终定位在膜的两极[13]。生长素极性运输抑制剂也影响着PIN蛋白的表达与分布。当添加抑制剂后，野生型拟南芥与PIN突变体有着相似的表型。天然生长素运输载体抑制剂萘基邻氨酰苯甲酸，可能通过NPA结合蛋白与肌动蛋白相互作用，调控着ＰＩＮ 蛋白的囊泡运输和极性定位。在其他物种也发现了多个AtPIN家族的同源基因。水稻中鉴定出了12个PIN家族成员。水稻有 4个AtPIN1同 源 基 因，分 别 为 OsPIN1a、OsPIN1b　、OsPIN1c、OsPIN1d。 通 过 对OsPIN1a-gus转基因水稻和荧光定量pcr的研究表明，OsPIN1a在幼穗、叶片及根系中均有表达，其中在幼嫩的组织中表达最高，如刚萌发种子的胚芽鞘、花药和柱头。OsPIN1a受外源生长素处理而诱导表达，受生长素极性运输抑制剂的抑制；OsPIN1b与AtPIN1高度同源，在侧根原基和维管组织中表达，对OsPIN1b基因的过量表达株 系 和 干 涉 株 系 的 表 型 分 析，结 果 表 明，OsPIN1b在水稻分蘖、地下部和地上部比例及不定根的发 育 中 具 有 重 要 调 控 作 用[14]。过 量 表 达 OsPIN2基因 抑 制OsLAZY的 表 达 导 致 叶 夹 角 增大，OsPIN2过表达转基 因 水 稻 地 下 部 对NPA不敏感，暗示OsPIN2是编码1个输出载体[15]。OsPIN3在维管组织中强烈表达，参与生长素应答干旱胁迫[16]。OsPIN10a和 OsPIN10b在蛋白结构上有1个长的中间亲水环，根据组织特异性表达模式分析，它们可能参与水稻的分蘖过程。分析表明，OsPIN10a在茎、叶和 幼 穗 中 表 达，但 不 在 根 中 表达。OsPIN10b主要表达在叶片，也在茎基部和横向侧根原基处表达，OsPIN10b基因在IAA、6-BA和JA处理下表达上升，在玉米基因组中共鉴定出了12个ZmPIN家族成员，其中4个AtPIN1同源基因，1个AtPIN2同 源 基 因，3个 AtPIN5同 源 基 因 ，11个 AtPIN8同源基因，3个单叶子特有 的PIN基 因。ZmPINa-b这4个基因在不同组织中呈现不同的极性分布模式。ZmPIN1d的转录产物在顶端分生组织和花序分生组织的 L1层细胞中被检测到。ZmPIN5b蛋白极性分布在细胞基部（细胞的下端），可能参与维管组织的分化。单子叶特有的ZmPIN9基因在根内皮层和中柱鞘中表达。在地上部多数ZmPIN基因受盐、干旱胁迫诱导表达，而在 根 中 其 表 达 被 盐、干 旱 胁 迫 抑制。在杨树中有15个PIN家族成员，包括4个PIN1，1个PIN2，2个 PIN3，3个 PIN5，3个PIN6，2个PIN7等6类基因。相对拟南芥，杨树中的PIN基因表达更多元化，研究结果为PIN 家族对树木的生长发育的功能提供了重要的线索。马铃薯中StPIN2 在花芽，匍匐茎的维 管 组织，生长中的块茎储存实质中表达，StPIN4在雌蕊柱头、花瓣、子 房、茎 维 管 组 织 和 块 茎 的 实 质 细 胞 中 表达。番茄中StPIN1和StPIN2在幼嫩的果实中强烈表达。分别降低StPIN3和StPIN4的表达，茎的结构就会改变。

2. 研究的基本内容和问题

研究的目标：水稻pin蛋白家族

研究的内容：水稻pin蛋白家族相关信息

关键问题：如何设计实验

3. 研究的方法与方案

1.准备植物材料 2.抗体的制备与检测 3.免疫杂交和免疫组化检测 4.生物信息学分析

4. 研究创新点

无

5. 研究计划与进展

在不同农作物的根表皮细胞中，ospin1 及其同源物的定位是非极性的。ospin1b 的氨基酸序列与 atpin1 具有 58.6%的相似性，因此，不同作物和拟南芥 atpin1 蛋白的亚细胞定位模式存在的差异可能与不同植物中 pin1 蛋白结构差异有关

pin 蛋白由于胞吞作用而产生的细胞定位的改变可影响生长素的极性运输，从而进一步调控器官形成ospin1b 可以通过胞吞途径进入到细胞质中。这显示由于细胞的胞吞作用，ospin1b 及其同源物的细胞质膜及细胞质定位可能会发生变化，并参与调控植物内生长素的分布。pin 蛋白的细胞定位可受到其它物质如水杨酸的调控(du et al.,2013)。但是 ospin1b 的定位可由于自身胞吞作用而改变，因此，不同作物中 pin1 蛋白的亚细胞定位是一个动态的过程。