干旱胁迫下秀丽隐杆线虫的响应机制开题报告

1. 国内外研究概况

（1） 土壤线虫生长繁殖受到干旱条件的强烈制约

土壤线虫是土壤动物的重要组成部分，他们种类丰富，数量繁多，分布广泛。土壤环境提供线虫群落适宜生存或生活的条件, 影响和调控其群落多样性和分布；同时线虫在食物网中也占据重要的地位，参与到土壤有机质、养分循环、分解和还原营养物质等作用，它们与土壤环境既相互依存，又相互制约（Bongers and Ferris, 1999; 张晓珂等. 2018），因此，土壤线虫的群落组成及生态指数可用来反映土壤环境质量（Schloter et al., 2003; Ugarte et al., 2013）。

线虫是湿生性生物，生活在土壤间隙水中，因此土壤水分对线虫数量和群落结构的影响非常大，过高或过低都会对线虫的生长和繁殖不利。李萌等.(2014)对在短期水分变化的土壤线虫进行研究，发现随着土壤含水量逐渐增高，线虫数量先增加后减少。Bakonyi and Nagy（2000）研究表明，在淹水状态下，土壤缺氧，并产生丁酸、丙酸、硫化氢等一系列化学物质，均抑制线虫的生长繁殖，线虫也会出现表面聚集的现象，而随着土壤淹水时间的加长，土壤线虫的总密度和类群数显著降低。在长期干旱的状态下，土壤线虫的优势种增加，均匀度指数降低，群落结构退化。干旱条件下，细菌数量减少，而真菌数量变化不大（Geng et al., 2015），因而，干燥环境不利于食细菌性线虫的生长繁殖（Evans and Burke, 2014; Song et al., 2016），更利于食真菌线虫种群扩增。通过实验室培养实验发现食细菌线虫拟丽突属Acrobeloides与水分呈正相关,食真菌线虫滑刃属线虫Tylenchida与水分呈负相关（Sohlenius, 1985）。Landesman.(2011)研究发现，所有营养类群线虫均对干旱敏感，而食细菌线虫表现最为明显。但也有研究发现在属水平下，食细菌线虫真头叶属Eucephalobus和植物寄生线虫螺旋属Helicotylenchus是干旱处理中的优势属（Yan et al., 2018）。土壤线虫在短期干旱后对干旱具有一定的耐受性（Vries et al.，2012），但不能适应突然干旱的变化。持续干旱将破坏土壤线虫群落组成和结构的原始平衡，并影响其生态功能。

（2） 秀丽隐杆线虫Caenorhabditis Elegans耐旱作用机制

干旱条件使C.elegans在表型上有所改变。Bergmann法则认为，同种动物生活在寒冷地方的个体其体积、体重一般较之生活在温暖地方的个体为大。近年来的的气候变化可能比过去的历史气候变化快，所以许多生物可能反应或适应的速度不够快，这可能会导致物种灭绝，而可以适应的物种是受到潜在体型下降影响的物种（Sheridan and Bickford, 2011）。Wiest等.(2018)认为在古新世-始新世的热最大值（PETM，Palaeocene– Eocene Thermal Maximum）的变暖时期中，把一些古土壤中的土著昆虫化石尺寸减小的部分原因归结于土壤湿度降低，一些无脊椎动物诸如甲虫，黄蜂，蚂蚁和蝉的洞穴无脊椎动物的大小缩小了50-75％（Smith et al., 2009）。线虫是一种无脊椎动物，它们在被动长距离的空间扩散中发展体积小的特性，使线虫易于运输，并能进化出一些如脱水，渗透等隐生能力使它们能够在不利的栖息地生存（Liu et al., 2019）。在南极洲的干旱谷的田间试验中，气候变暖会增加小型食细菌线虫Scottnema lindsayae的密度，同时大大降低大型杂食性线虫的密度。通过对食细菌性5种绕线属线虫进行不同温度的培养，Majdi等.(2019)发现线虫子宫中卵的数量决定体型，在较高温度下线虫产卵较少，则体型较小，其中成虫的体长在25℃-30℃都有所下降。

在受到环境胁迫时，线虫会进入Dauer期抵抗逆境。Erkut等.(2011)人的研究表明，Dauer幼虫是生命周期中唯一可以承受轻度干燥压力（暴露于98％相对湿度（RH））的存活阶段。线虫可通过卷绕成螺旋形减少线虫皮肤暴露在干燥环境中的表面积，从而减少身体水分的丧失速度（(Womersley and Higa, 1998; Shannon, 2005）。此外，Dauer期的幼虫不进食，幼虫被包裹在特有的强化表皮中（Tanaka et al., 2012），肠子被密封在嘴和肛门处，代谢活性取决于内部能量存储故而降低代谢速率，神经化学感应系统仍具有功能使线虫快速移动（Cassada and Russell. 1975）。Dauer是一个不会衰老的状态，一旦脱离逆境，幼虫会继续进入L3幼虫期，不会影响Dauer期后的寿命。

干旱条件诱导C.elegans分泌多种响应化合物。在C.elegans中被广泛研究的主要是海藻糖，胚胎发育晚期丰富蛋白（LEA）以及热休克蛋白（HSP）等。当线虫进入低湿休眠状态时，通常会分泌大量的海藻糖等糖类物质，Dauer线虫的新陈代谢模式转变为糖异生模式，将多种非碳水化合物生成糖（Erkut et al., 2016）。Erkut等.(2011)人在对Dauer线虫进行高RH干燥预处理后，线虫体内的海藻糖含量相对于正常以及未经过预处理线虫的5倍。这意味着在预处理过程中，Dauer线虫的体内会合成大量海藻糖。海藻糖与预处理过幼虫的细胞膜上的磷脂更有利地相互作用，保持脂质酰基链堆积状态，从而保护C.elegans的膜结构（Crowe, 2002）。除了海藻糖外，LEA也是参与细胞抗逆的一类重要化合物，能够阻止因干旱诱导的亲水性蛋白质的聚合（Chakrabortee et al., 2007）。目前在动物中检测到的所有LEA序列均属于第3组，已有证明线虫的脱水反应过程中一些LEA3组蛋白会上调，其中ce-lea-1在秀丽隐杆线虫干旱胁迫表达时起着显著的作用（Gal et al., 2004）。除此之外，HSP在线虫耐旱性中也有重要作用，如热休克蛋白hsp-104与海藻糖在耐旱作用上有功能的重叠，并同为分子伴侣，但hsp-104常作用于短期干燥的细胞，而海藻糖更常作用于长期干燥的细胞，海藻糖和hsp-104协同促进细胞中蛋白质的稳态（Hugo and Douglas, 2014;Douglas et al., 2019）。

干旱条件诱导C.elegans某些功能基因的表达。目前已报导过的食细菌性耐旱线虫有3种：广杆线虫属C. elegans、盆咽属 Panagrolaimus 和绕线属 Plectus。在干旱胁迫下C. elegans目前较为明确的基因有胚胎发育晚期丰富蛋白基因lea-1、dur-1，抗氧化基因sod-5、gpx-6、djr-1.2、glod-4 (Erkut et al., 2013)。据Mulvihill（2014）统计，干旱胁迫下C.elegans涉及的上调基因4667个，下调基因3907个。上调基因的映射出的信号途径包括Ras和促分裂原活化蛋白激酶 (MAPK, mitogen-activated protein kinase)的信号转导，未折叠蛋白（UPR，unfolded protein response）信号转导、胰岛素（Insulin/IGF）受体信号转导以及神经元信号转导。在C.elegans中，影响Insulin/IGF信号传导（IIS）途径中许多基因的突变可延长寿命。体长与寿命之间存在显著的正相关。在L2时期前，IIS突变会导致体型瘦弱，滞育的Dauer幼虫的形成，从而影响幼虫的体型；蜕皮成虫后体内IIS突变，IIS适度减少可能会导致线虫长度和直径成比例增加，而IIS的严重减少可能会导致长度增加，但宽度减小（Mcculloch and Gems, 2003）。以上信号传导途径通过以下三条途径保护干旱胁迫下的线虫。第一，细胞骨架和细胞膜的重组。在干燥环境中，细胞骨架中的微管会发生降解，不能重塑排列调节细胞生长（马晓丽和冀瑞萍，2016），因而，肌动蛋白和微管蛋白的合成途径会上调保护细胞膜。第二，利用抗氧化剂清理线虫体内氧化物，进行DNA修复、蛋白酶修复和自噬作用，减小干旱对线虫带来的毒性。第三，利用热休克蛋白、伴侣蛋白、胚胎晚期丰富蛋白、相容性溶质对线虫进行保护。尽管目前对C.elegans的耐旱机制已有部分进展，但大多数基因在细胞内信号转导路径所扮演的角色还未明晰，在干旱胁迫下的表达方式还有待明确，尤其直接或间接影响线虫体型的基因仍未见报道。

2. 本课题的意义

近年来全球极端气候频繁发生，据联合国政府间气候变化专门委员会第一工作组预测，在全球持续变暖的趋势下，到21世纪末，中纬度大部分陆地区域与热带区域的湿区，极端降水事件将很可能更剧烈并更频繁。气候的异常变化导致干旱等极端条件下的土壤生物多样性变化越来越受到国内外学者的关注。脱水耐受性，是陆地环境中生命进化的关键特征，利用相应的机制来应对波动环境带来的胁迫。C.elegans是一种典型脱水生物，在干旱条件下能做出生理生化和基因表达上的响应，并有理论研究表明在全球变暖的背景下，动物的体型会发生变化。本研究选择C.elegans为研究对象，在一定条件下诱导其耐旱基因的表达，从分子水平进一步明确与耐旱相关、挖掘与线虫体积相关的功能基因，揭示线虫耐极端干旱条件的内在分子机制。通过对C.elegans耐旱分子机制的研究能够为线虫生态功能的挖掘奠定理论依据。

1. 研究目标

从分子水平进一步明确与耐旱相关、挖掘与线虫体积相关的功能基因，揭示线虫耐极端干旱条件的内在分子机制，为线虫生态功能的挖掘奠定理论依据。

2. 研究内容

在前人研究的基础上，已发现较为明确的耐旱线虫中主要耐旱相关功能基因主要有C.elegans中的胚胎发育晚期丰富蛋白基因lea-1、dur-1，抗氧化基因sod-5、gpx-6、djr-1.2、glod-4 (Erkut et al., 2013)，还有在其他线虫中发现的耐旱功能基因如盆咽属 Panagrolaimus中的抗氧化基因 prx，绕线属Plectus中上调的海藻糖磷酸合成酶基因tps、活性氧清除酶基因gst-1，除此之外还有一些显著下调的基因如抗冻蛋白基因afp 和糖原合成酶基因gsp (Adhikari et al., 2009)。Mulvihill（2014）虽然统计了干旱条件下C.elegans中上调、下调的基因，但除了以上的基因，还有许多基因仍未被具体的验证是否直接或间接关系到线虫的耐旱能力，也未清楚这些差异基因在C.elegans行使相关功能时所存在的意义，未明确其表达的路径；此外关于在干旱胁迫下影响线虫体积大小的相关基因未见报道。因此本研究主要从基因水平进一步明确与耐旱相关、挖掘与线虫体积相关的功能基因，揭示线虫耐极端干旱条件的内在分子机制。

实验会将已知耐旱的模式线虫C.elegans，通过密封罐中饱和溶液K₂Cr₂O₇提供相对湿度98%的环境，诱导线虫耐旱功能基因的表达；同时通过查阅文献，找到可能的作用的与线虫体积相关的耐旱功能基因，并且使用转录组测序分析（RNA-seq），与常规培养条件下的C.elegans对比相关基因的变化，筛选差异基因；通过qRT-PCR试验确定基因的表达量，以此确定该基因的表达是否与干旱相关。然后设计耐旱相关功能基因探针，确认基因的存在，最后利用RNAi技术使耐旱基因沉默，验证突变体线虫的耐旱能力，观察线虫体积，体型，体态的变化。

3. 拟解决的关键问题

研究模式线虫C.elegans新的耐旱相关功能基因，重点关注与线虫体积相关的耐旱功能基因。从分子、基因的角度揭示线虫耐干旱的内在分子机制，解释造成线虫体积变化的作用途径及全球气候变化下线虫体积的变化原因。

1. 研究方案与关键技术

本课题将实验分成4个阶段。

（1） 耐旱线虫功能基因诱导

a) NGM（Nematode Growth Medium）线虫培养基的制备

在500ml的锥形瓶中依次加入0.9gNaCl，0.75g蛋白胨，5.1g琼脂，蒸馏水300m1。经过121℃高压灭菌20min后加入7.5ml 1mol/L K₂HPO₄-KH₂PO₄缓冲液（pH=6.0），0.3ml 1 mol/L MgSO₄，0.3ml 1 mol/L CaCl₂，0.3ml胆固醇溶液（5 mg/ml乙醇），接种大肠杆菌E. coli至线虫培养基培养。

b) C.elegans耐旱基因的诱导表达

用无菌水冲洗培养皿表面成虫期的C.elegans至 50ml 离心管中，加入 20 ml 30%的蔗糖溶液离心浮选，用去离子水洗涤3次。用移液枪吸取上层线虫分装至两个1.5 ml EP管，其中一份为对照组C.elegans，用液氮速冻后置于冷冻干燥器 24 小时脱水后保存于-70℃冰箱。另一份C.elegans真空过滤至0.45μm的滤膜后将线虫样本置于相对湿度为98%（通过饱和溶液 K₂Cr₂O₇ 来实现）的环境中24小时，再置于放有硅胶的相对湿度为10%的环境中48小时以诱导干旱基因的表达，用液氮速冻后置于冷冻干燥器24小时脱水后保存于-70℃冰箱。耐旱基因的诱导表达方法参见 Browne et al. (2004) 。

（2） 第二阶段，耐旱相关功能基因的筛选

a) C.elegans RNA的提取

将对照组C.elegans和耐旱条件诱导过的C.elegans从-70℃冰箱取出，转移至 DEPC水处理过的EP管，缓缓加入液氮充分研磨，粉末依照试剂盒操作规程进行总RNA的提取。使用Thermo Nnodrop 2000检查提取的 RNA 的浓度和纯度，合格的RNA直接用于反转录合成cDNA。剩余的RNA样品可保存在-70℃冰箱中。

b) RNA-seq 测序

用带有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA，对mRNA中进行片段化，再以片断后的mRNA为模板，用引物合成cDNA第一链，并加入缓冲液、dNTPs、RNase H 和DNA polymerase I 合成cDNA第二链，经过QiaQuick PCR试剂盒纯化并加 EB缓冲液洗脱经末端修复、加碱基A，加测序接头，再经琼脂糖凝胶电泳回收目的大小片段，并进行PCR扩增，从而完成整个cDNA文库制备工作，构建好的文库进行高通量测序，获得C.elegans所有转录组信息，筛选出对照组C.elegans和耐旱诱导过的C.elegans具有表达差异的基因进行对比，可以获得耐旱诱导过的C.elegans基因表达明显上调或者明显下调的变化情况，初步确定C.elegans的耐旱基因。将初步确定的耐旱基因进行功能分类，如防御基因，代谢基因，蛋白表达基因等等。其次，与已知在C.elegans和其他线虫属中的耐旱基因对比，筛选可能与耐旱及体积相关的功能基因，将耐旱基因与其他动物体中有关体型变化的基因相比对，如IIS途径中的相关基因（daf-2），进一步确定与线虫体积相关的耐旱功能基因。

（3） 第三阶段，耐旱相关功能基因的确认

通过qRT-PCR试验确定基因的表达量，以此确定该基因的表达是否与干旱相关，设计耐旱相关功能基因探针，在C.elegans中进行扩增，确认该基因的存在。最后，利用RNAi技术使C.elegans体积相关的耐旱基因沉默，获得其体积相关耐旱基因缺失突变体。将突变体线虫以及野生型C.elegans，置于干燥低湿条件中观察是否能够存活，测定存活率，验证其耐旱能力，从而确定C.elegans与耐旱相关功能基因。

（4） 第四阶段，测量与比较C.elegans突变体体积

将突变体和野生型C.elegans再次诱导耐旱基因后，在干燥低湿条件中，放在琼脂平板上，使用解剖显微镜对其进行测量，目镜刻度用载物台千分尺校准。测量线虫的体长与体宽，将C.elegans当做圆柱形（v=πr²l），并对C.elegans进行称量得到线虫体重，并估算线虫干重，将所得到的数据与同样在干燥低湿环境中的野生型C.elegans体积进行比对及数据分析，确认该基因能够调节线虫体积使线虫在干旱胁迫下生存。

2. 技术路线

3. 可行性分析

（1）研究平台保障：本项目所在的研究室是我国高等院校中最早成立的土壤生态专业研究机构，依托农业资源利用国家一级学科重点学科和江苏省生态学一级学科重点学科，长期致力于土壤生态系统研究，在土壤动物（主要为线虫、蚯蚓、原生动物）和微生物方面拥有丰硕的科研成果。研究室具有开展本项目的全部设备和实验条件。

（2）理论基础和技术手段成熟：本项目实验设计思路清晰，室内可操作性强，技术路线合理，且所需要采用的分子研究方法已经在其他耐旱线虫中成熟运用，因此确保了研究方向及技术手段的可行性。

通过诱导、筛选、确认C.elegans体内耐旱相关功能基因，验证C.elegans的体积变化及其耐旱能力，深入到分子水平进一步明确与耐旱相关、与线虫体积相关的功能基因，揭示线虫耐极端干旱条件的内在分子机制，丰富对线虫体型变化的相关耐旱基因的认知，为土壤线虫生态功能挖掘奠定理论依据，为全球变化下动物体积的变化提供相关证据。

1. 研究计划

2020.03 诱导C.elegans耐旱功能基因，并提取对照组和处理组的C.elegans RNA，进行测序。

2020.04对比对照组和处理组的基因图谱，确定发生变化（上调、下调）基因，并与已知在其他线虫属中的耐旱基因对比，初步筛选可能与线虫体积变化的相关耐旱功能基因。

2020.04-05 设计耐旱相关功能基因探针，在C.elegans中进行扩增，确认该基因的存在。利用RNAi技术使C.elegans的耐旱基因沉默，获得其耐旱基因缺失突变体，验证其对线虫体型的改变及耐旱能力。

2020.05 完成毕业论文。

2. 预期进展

（1） 明确C.elegans在干旱条件下与线虫体积相关的功能基因，揭示线虫耐旱的内在分子机制；

（2） 完成本科毕业论文1篇。