1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
砷（as）是全球分布广泛的一种有毒类金属，带来的土壤污染、土体污染等问题不容忽视，人类活动如砷开采、金属冶炼、含砷除草剂过度使用等，导致稻田土壤受到严重的砷污染 [1]导致稻米中砷含量超标。水稻在我国粮食生产中占据了重要位置，中国超过60%的人口以稻米作为主食[2]，因此，稻米砷污染对人体健康造成潜在威胁[3]。
水稻土中的砷形态多样，主要包括无机三价（as(iii)）、无机五价砷（as(Ⅴ)）、以二甲基砷（dmas）为主的有机砷以及少量的挥发性胂（图1），而稻米中砷主要以as(iii)及dmas形态存在。不同形态的砷毒性也不同，一般来说，无机砷的毒性往往大于有机砷，但也有研究发现三价态的有机砷（mas(iii)）毒性比无机砷高数倍[4]。好氧条件下，水稻土中主要以无机as(v)为主，as(v)吸附于铁锰矿物和氧化铝矿物表面；淹水后，as(v)被还原释放转化为as(iii)，由于铁氧化物对as(iii)吸附能力弱，因此，因此as(iii)具有更强的移动性和生物可利用性。近来有研究发现在单甲基三价砷mas(iii)通过生物转化生成，再由其体内的外排酶排出的过程中，由于mas(iii)的毒性较高，微生物可以利用mas(iii)杀死其周边微生物，从而达到生长优势，这与抗生素的机理类似，因此被研究者认为是一种新型抗生素[5]。但是，通过长时间的进化导致部分微生物对mas(iii)也产生了一定的耐性，菌株将mas(iii)外排或者将其转化为低毒砷化物的过程实现了其对mas(iii)的耐药性。这些过程包括：arsp及arsk介导mas(iii)的外排过程[6、7]，arsh介导的mas(iii)的氧化过程[8]以及arsi催化mas(iii)的脱甲基过程。其中arsi催化mas(iii)的脱甲基过程是将mas(iii)转化为无机砷的过程，该过程除了降低mas(iii)的毒性外，也实现了有机砷到无机砷的转化过程，在砷的生物地球化学过程中发挥着重要的作用。
2011年yoshinaga等研究发现佛罗里达高尔夫球场土壤某种微生物可将mas(v)脱甲基成as(iii)，并发现mas(v)需还原为mas(iii)后才能被脱甲基，因此mas(iii)是脱甲基真正底物。研究者进一步分离提取出可将mas(v)还原为mas(iii)的菌株burkholderiasp. mr1和可将mas(iii)脱甲基为as(iii)的菌株streptomycessp. md1，将两种菌株混合培养后可以进行完全的还原和脱甲基化[9]，yoshinaga等在2014年又分离出一株具有mas(iii)脱甲基能力的菌株bacillussp. czdm1，并在该菌株的基因组内鉴定到了功能基因arsi。[10]。pawitwar等[11]利用等温滴定量热、化学修饰，定点突变，荧光检测等检测方法揭示了arsi的酶学特性。关于mas(iii)在好氧条件下脱甲基过程及机理的研究已较深入，但是在厌氧环境下，mas(iii)脱甲基途径依旧未知。针对这一空白，本研究旨在探究参与淹水水稻土中mas(iii)的脱甲基过程及可能的机制。研究前期在厌氧条件下从水稻土中分离出一株具有mas(iii)脱甲基能力的反硝化菌株bacillussp. czdm1，并从其体内克隆出催化该过程的功能基因bcarsi。本研究试图在厌氧条件下从水稻土中分离出具有mas(iii)脱甲基能力的反硝化菌株bacillussp. czdm1，并阐明厌氧条件下菌株bacillussp. czdm1参与mas(iii)脱甲基的机制。研究有望揭示厌氧条件下新型抗生素mas(iii)的解毒机制，同时脱甲基途径涉及到了有机砷向无机砷的转化，因此也能补充厌氧生境中砷的生物地球化学循环。
2. 研究的基本内容和问题
1 研究目标
明确厌氧条件下菌株bacillus sp. czdm1体内bcarsi催化新型抗生素mas(iii)的脱甲基过程与反硝化过程耦合。
2 研究内容
3. 研究的方法与方案
1 研究方法及实验方案
1.1 本研究所用主要试剂
合成MAs(III)所用试剂及配方：
溶液A：吸取0.272 mL浓硫酸并定容至5mL
溶液B：称取1.241 g五水合硫代硫酸钠定容至5 mL
溶液C：称取0.95505 g焦亚硫酸钠定容至5 mL
溶液D：20 mM MAs(V)溶液
1 mM MAs(III)合成体系（50 mL）：
溶液A（1.35 mL） 溶液B（3.30 mL） 溶液C（4.10 mL） 溶液D（2.50 mL），最后采用NaOH调节pH至6.0。
表1 菌株Bacillussp.CZDM1所用培养基成分
| 基本培养基成分 | NaCl 1.17 g L-1, MgCl2·6H2O 0.4 g L-1, KCl 0.3 g L-1, CaCl2·2H2O 0.15 g L-1, NH4Cl 0.27 g L-1, KH2PO40.20 g L-1, Yeast extract 1 g L-1, NaHCO32 g L-1, 20mM NaNO3(电子受体), 20 mM succinate (电子供体). |
| 微量元素符合液(1000×) | FeCl2·4H2O 2g L-1, ZnCl2·0.07 g L-1, MnCl2·4H2O 0.1 g L-1, CuCl2·2H2O 0.002 g L-1, NiCl2·6H2O, 0.024 g L-1, H3BO30.06 g L-1, CoCl2·6H2O 0.19 g L-1, Na2MoO40.036 g L-1. |
| 维生素复合液（100×） | Biotin 2mg L-1, Folic acid 2 mg L-1, Pyridoixine-HCl 10mg L-1, Thiamine-HCl·2H2O 5mg L-1, Riboflavin 5 mg L-1, Nicotinic acid 5 mg L-1, D-Ca-pantothenate 5 mg L-1, Vitamin B12 0.1 mg L-1, p-Aminobenzoic acid 5 mg L-1, Lipoic acid, 5 mg L-1. |
1.2菌株Bacillussp. CZDM1的分离筛选和MAs(III)抗性检测
本研究在厌氧反硝化条件下采用滚管技术从郴州（CZ）砷污染水稻土中分离筛菌菌株。通过分析该菌株的16S rRNA基因序列并与前期分离得到的Bacillussp. CZDM1菌株基因序列作比较，确定分离得到同种微生物。同时为了探究该菌株对MAs(III)的抗性，本研究在培养菌株的同时向其中添加不同浓度的MAs(III)，浓度梯度为0，2，4，6，10 μM。菌株培养选用的培养基具体配方见表1，待菌株培养36小时后，取样测定菌株的OD600nm并进行分析。
1.3发酵条件下菌株Bacillussp. CZDM1的MAs(III)的脱甲基能力检测
在厌氧发酵条件下培养菌株，并添加2 μM MAs(III)。发酵选用基础培养基与反硝化培养基一致，将碳源更换为葡萄糖并不添加电子受体。在菌株培养过程中，采用注射器定时收集2 mL培养液，其中1 mL培养液直接用于分析OD600nm，剩余部分离心并过0.22 μm的滤膜，样品经稀释后用于分析其中砷形态、硝酸根（NO3-）、亚硝酸根（NO2-）。砷形态分析采用HPLC-ICP-MS (Perkin Elmer, USA)，NO3-及NO2-采用比色法分析。
1.4反硝化条件下菌株Bacillussp. CZDM1的MAs(III)的脱甲基能力检测
若发酵条件下菌株MAs(III)不具备MAs(III)的脱甲基能力，则将发酵培养后的菌株全部转移到反硝化培养基中，验证其MAs(III)脱甲基能力能否恢复。具体操作如下：首先发酵培养该菌株并向其中添加2 μM MAs(III)。待培养48小时后，在厌氧手套箱中将菌体全部离心收集，并全部转接至反硝化培养基中，同时添加2 μM MAs(III)，继续培养48小时。在培养过程中每隔24小时取样分析其中砷形态。
1.5发酵及反硝化条件下arsI基因的表达
在发酵（反硝化）条件下培养该菌株，待菌株培养48小时后，离心收集菌体并提取菌体总RNA，将菌体总RNA反转录成cDNA，并以该cDNA为模板采用荧光定量PCR来检测该培养条件下菌株体内arsI基因是否表达。在定量之前，根据基因组中鉴定到的arsI基因序列来设计特异性引物，同时选择该菌株基因组内促旋酶的B单位（gyrB）基因作为内参基因来进行定量。
1.6 N18O3-稳定同位素示踪试验
菌株培养时以N18O3-代替NO3-，同时以添加未标记的NO3-作为对照处理。为了减少同位素试剂用量，本研究将菌株培养体系缩小至2.5 mL，该试验共设计3个的处理：培养基 NO3- MAs(III)、培养基 N18O3- MAs(III)、菌株 NO3- MAs(III)、菌株 N18O3- MAs(III)，每个处理设置3个重复。待菌株培养48小时后，收集样品并分别利用HPLC-ESI-MS/MS (Agilent 1200 series HPLC and a G6410B triple quadrupole mass spectrometer)及HPLC-ICP-MS分析其中砷形态.
2 技术路线
3 可行性分析
（1）项目开始前已取得部分研究成果，为本项目提供了理论基础。实验室在厌氧条件下从湖南郴州砷污染土壤中分离得到一株能将MAs(III)脱甲基的反硝化菌株，且在该菌株体内鉴定到一个与典型ArsI相似的BcArsI蛋白，并且通过异源表达证明BcArsI在厌氧反硝化条件下依然具有MAs(III)的脱甲基能力。同时前期好氧实验结果证明ArsI催化MAs(III)脱甲基过程需要消耗O2，为本研究中厌氧条件下NO3-可以代替O2完成由ArsI介导的MAs(III)脱甲基过程的假说提供了可能性。
（2）实验室有很多优秀前辈研究砷污染相关课题，为实验操作指导和项目思路提供了帮助。本人曾参加主持过大学生创业创新项目（SRT），对实验原理和基本操作有一定了解。
4. 研究创新点
（1）首次在厌氧条件下分离鉴定出一株具有MAs(III)脱甲基能力的反硝化菌株Bacillussp. CZDM1。
（2）ArsI依旧参与厌氧条件下MAs(III)的脱甲基过程，且NO3-可代替O2实现ArsI催化MAs(III)脱甲基过程。
5. 研究计划与进展
2019年12月- 2020年3月
（1）阅读砷污染及砷脱甲基化相关文献资料，了解已有研究结果；
（2）完成菌株bacillus sp. czdm1在厌氧发酵条件及发酵转反硝化条件下mas(iii)脱甲基能力检测；
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