黄瓜根际固氮细菌的分离与鉴定开题报告

研究意义：

生物固氮，是指固氮微生物以自生固氮、共生固氮和联合固氮的形式将大气中的氮气转为氨的过程。固氮微生物都是原核生物，至今还没有发现能够固氮的真核生物。生物固氮在提高农作物产量、降低化肥使用量、减少水土污染、保持农业可持续发展、降低能源消耗、影响海洋氮素循环和海洋生物进行光合作用方面具有重要作用，研究生物固氮是当前农业发展的一项热点话题。

黄瓜是一种经济价值很高的蔬菜作物，黄瓜富含蛋白质、糖类、维生素B2、维生素C、维生素E、胡萝卜素、尼克酸、钙、磷、铁等营养成分。但是，在黄瓜种植的过程中存在着很多培育问题，如黄瓜喜湿而不耐涝、喜肥而不耐肥，并且易感染诸如霜霉病，灰霉病等真菌型病害。因此，在种植黄瓜时需要考虑多方面因素，针对于种植黄瓜对于施肥条件要求苛刻，宜采用生物有机肥对其进行施肥，黄瓜根际环境是黄瓜根系生长发育、吸收营养成分和新陈代谢的场所，同时黄瓜根系的生长与土壤中栖居的有益微生物群落息息相关。近年来由于绿色农业的发展各领域学者对于，小麦，水稻等主要粮食作物的根际固氮菌都有一定的研究，但是对于黄瓜根际固氮菌研究较少，因此，此次研究意在对于黄瓜根际固氮菌进行初步研究，以期对黄瓜种根际固氮菌进行初步筛选与鉴定。

国内外研究进展：

对于固氮菌对于黄瓜生长的影响，湖南农业大学已经发现外加固氮菌剂有利于幼苗生长和干重增加。因此筛选出适宜黄瓜根际生长的高效固氮菌，不仅有助于黄瓜生长还具有良好的经济效益，海城市与没施的相比施用菌剂的黄瓜瓜蔓粗叶片厚瓜条直，瓜色深绿有光泽瓜甜，且有清香味口感好每亩产黄瓜1万公斤比不施固氮菌剂的多产10

多公斤增产10%，因此筛选出高效黄瓜固氮菌株，具有十分重要的现实意义。

然而，提高黄瓜产量的关键肥料为氮肥。但是，50%以上氮肥由于挥发作用、脱氮作用和淋失，造成严重的能源浪费和环境问题，结合黄瓜根际易感病容易造成连作障碍，无机肥料施用常常对这些问题解决无力，为避免造成环境污染和能源浪费问题，寻找黄瓜根际高效固氮菌种，结合实际施用生物菌肥是首选。为此，常选用联合固氮菌种，联合固氮是自由生活的固氮菌定殖于植物根表、近根土壤或部分侵入植物根皮层组织或维管中形成的特殊固氮作用。研究表明，联合固氮菌广泛存在于非豆科植物的根际、根表和根皮层中。联合固氮菌除了能为宿主提供氮素以外，还同时具有溶磷、分泌生长素、增强植株抗病性、抗逆境等多方面的促进植物生长的作用。用这类菌研制的生物肥料具有成本低、持续效果好、增产稳定、非再生能源消耗少及对环境、食品安全等特点。同时，可以改善土壤结构，提高土壤有机质含量，改良盐碱地，保障农牧业的可持续发展。近年来，人们对非豆科植物与根系联合的特殊固氮菌展开了广泛研究。禾本科作物是对氮肥最具依赖性的作物，利用联合固氮细菌在禾本科植物根部的固氮作用，在一定程度上可减少化学肥料的使用。至今报道具联合固氮能力的禾本科植物至少有40属100种目前已知固氮微生物广泛的分布在原核生物和古核生物中，既有异养型，又有自养型;既有需氧型，也有厌氧型，还有兼性型。固氮微生物生活习性和代谢类型的多样性揭示了其资源和生物固氮体系的多样性。固氮菌的筛选主要依靠其代谢产物，固氮菌是一类能够进行生物固氮的微生物，由于它们能够直接利用空气中的分子态氮素，因此生命力很强，能够在贫营养等恶劣环境中生存并且进行生命活动，在农业生产和生态环境修复中具有广泛的应用。前人对水稻、小麦、玉米、燕麦、高粱和甘蔗等，禾本科植物根际联合固氮菌的促生效应进行了较深入研究。张堃等从燕麦和盐碱地小麦根际筛选的优良联合固氮菌对青稞主根长度(乳熟期)、地下生物量(完熟期)、粗蛋白含量(抽穗期、灌浆期和乳熟期)、子粒产量均有显著的促进作用。但不同生境和植物，固氮菌的种类和特性不同，因此，从特定生境和植物根际分离获得高效固氮菌株以研制适合不同生境和植物的专用生物菌肥具有十分重要的意义。

对于固氮菌的筛选目前采用对固氮菌代谢的特定产物的鉴定方法。乙烯是高等植物的内源激素，1-氨基环丙烷-1-羧酸（1-aminocyclopropane-1-carboxylate，ACC）是乙烯合成的前体，近年来发现，许多植物促生细菌（Plantgrowthpromotingbacteria，PGPB）具有ACC脱氨酶活性，因此人们采用检测ACC脱氨酶的方法来筛选植物促生细菌。在菌株的鉴定上目前采用采用16SrRNA基因测序、比对法鉴定筛选到的高效菌株。DNA测序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成，序列比对通过美国国家生物技

信息中心NCBI数据库和EzTaxon在线完成。

菌株固氮能力的测定采用微量凯氏定氮法测定菌株的固氮量。菌株活化后在Ashby无氮液体培养基上生长，每个菌株取1mL菌液加入装有50mLAshby无氮液体培养基的三角瓶中，置于28℃，180r·min－1摇床上培养10d，Ashby无氮培养液作为对照。培养结束后，12000r·min－1离心30min，上清液利用微量凯氏定氮法测定各处理的氮含量。含氮量根据以下公式进行计算:氮含量(mg·L－1)=［(V1－V2)×14×1000］/V式中，V1为样品滴定时用去的标准盐酸溶液体积(mL);V2为空白滴定时用去的标准盐酸溶液体积(mL);14为每毫摩尔氮的毫克数;V为菌株取液量(mL)。

应用前景：

研究分析得出结果可为后对黄瓜根际固氮菌的纯化和基因鉴定打下基础，为得出高效黄瓜根际固氮菌做出初步的筛选，得出的高效菌种可用于续微生物接种剂或黄瓜固氮菌肥的研制与应用提供了菌种资源和理论依据,今后可扩大培养固氮菌株,进一步研究菌株对黄瓜的实际促生效果，符合绿色发展农业的具体要求。