水稻OsNRAMP2克隆与功能研究开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

植物通过各种的离子转运通道从外界吸收并转运必需矿质元素，以维持正常的生长发育^[1]。同时，还有一些非必须矿质元素能通过其它必需元素的转运途径进入植物体内，如镉(cd)、铅(pb)、砷(as)等，这些元素不仅对植物本身有害，还能通过食物链进入人体，从而危害人类健康^[2-3]。

水稻是世界重要的粮食作物，在中国种植面积广泛。但近年来由于工业化的发展，污染物的过量排放，土壤镉污染导致水稻镉超标的问题日益严重^[4-5]。大米镉超标会严重威胁人类健康，引起多种疾病，所以粮食安全问题成为了人们关注的重点。降低水稻镉含量通常有两种方法：一种是降低土壤中的镉含量，从而降低植株的吸收量; 另一种是选育低镉吸收的水稻品种，从植物本身来降低镉含量。阐明水稻对镉的吸收和转运的分子机理，找出水稻中相关重金属转运的基因，有利于培育低镉品种。目前研究者已不断发现各种与重金属转运相关的基因家族，其中水稻nramp家族基因在水稻镉的吸收与转运上发挥着重要的功能，但整个家族基因的功能研究还不完全，亟待完善。对水稻nramp家族基因的功能进行研究，并探讨其在农业生产和生物工程应用的可能，可以为今后相关低镉水稻品种选育提供理论支持。

转运蛋白nramp是一种天然抗性相关巨噬细胞蛋白。nramp蛋白在金属离子转运中起着重要的作用，广泛存在于微生物、植物以及动物体内，其运输的二价金属阳离子有铁、锰、镉、锌和铜等^[6-8]。nramp基因在多种植物中被检测到^[9]，但nramp家族基因与多种离子都具有亲和能力且作用方式多样^[10]，所以需要对水稻中的nramp基因参与镉离子的转运进行进一步的了解。

2. 研究的基本内容和问题

1.研究目标

水稻nramp家族基因经研究发现与镉离子运输有关的主要有四个，分别为osnramp1，osnramp2，osnramp5和osnramp6，其中osnramp2基因的功能与作用不太明确。前期研究发现osnramp2定位在液泡膜上，且在酵母中异源表达osnramp2能增加细胞的镉敏感性。但是其在水稻体内的功能尚不明确，本研究通过构建crispr/cas9敲除突变体以及一系列的水培实验探究osnramp2在水稻体内的功能。

2.研究内容

3. 研究的方法与方案

1.实验方案

（1）基于单子叶crispr/cas9系统的osnramp2敲除体系的构建和转基因材料的获得

利用getaway体系的crispr/cas9表达系统构建osnramp2的敲除载体。将构建好的表达载体转入中花11愈伤组织中，获得基因敲除材料。

4. 研究创新点

植物受到镉胁迫时会通过基因的表达来调节镉离子的吸收和转运。在各种基因中，水稻NRAMP家族基因经研究发现与镉离子运输有关的主要有四个，分别为OsNRAMP1，OsNRAMP2，OsNRAMP5和OsNRAMP6。其中只有OsNRAMP2基因的功能与作用不太明确，不能确定其是否对水稻中镉的运转起到重要作用。目前所了解到的有OsNRAMP2与Cd的吸收有关，OsNRAMP2主要在经镉处理的高镉积累的幼苗中被诱导。亚细胞定位分析表明OsNRAMP2会在水稻原生质体中表达。OsNRAMP2定位在液泡膜上，表达的OsNRAMP2有微弱Cd的转运活性，但是没有突变体的验证也没有回补。

所以本实验的创新之处在于对OsNRAMP2基因表达相关进行进一步的研究，通过水培实验，探究敲除OsNRAMP2对水稻元素积累和水稻生长的影响，以及水稻中OsNRAMP2表达对必需金属元素缺乏和不同镉处理的响应，明确OsNRAMP2在水稻体内的功能。

5. 研究计划与进展

1.研究计划

（1）2020年3月，对已有的水稻材料按实验方案进行水培处理。

（2）2020年4月，进行敲除osnramp2对水稻元素积累和生长表型的影响及水稻中osnramp2表达对必需金属元素缺乏和不同镉处理的响应的探究。通过实验进行测定，对得到的数据进行分析总结。