解淀粉芽孢杆菌SQR9合成的一种新型聚酮类化合物的纯化及其相关基因岛分析开题报告

解淀粉芽孢杆菌SQR9（Bacillus amyloliquefaciens SQR9）是一种嗜热、好氧的革兰氏阳性细菌，生理特征丰富多样，极易分离培养，能产生多种抗菌素和酶^[1]，具有良好的生防及促进植物生长的作用^[2,3,4]。

因此对于SQR9深入研究是非常有必要的,我们截取SQR9次级代谢产物中的多聚酮类化合物进行研究，探索合成SQR9特有次级代谢产物中多聚酮类化合物的合成酶(下简称PKS)。

聚酮类化合物是一组含有由碳、氧原子构成的大环结构的天然化合物,是许多药物的先导化合物,例如红霉素、四环素、两性霉素、利福霉素、洛伐他丁、阿霉素、FK506、雷帕霉素等^[5]，具有广泛的药用价值。随着抗生素生物合成基因克隆工作的广泛展开，国内外已有超过150种微生物次级代谢产物的生物合成基因簇被成功克隆和表达^[6]，尤其是聚酮类化合物的生物合成及其机理的研究更加详尽。Chen等^[7]人曾从Bacillus amyloliquefaciens FZB42中筛选到3个PKS的相关基因簇；Scotti等^[8]从Bacillus subtilis 的基因组中发现了一个编码PKS的开放阅读框(ORF)。遗传工程及组合生物学通过对聚酮类化合物生物合成相关基因的改造，生产新的同系物，获得新抗生素^[9,10]。

从PKS的结构和作用机制上看，PKS主要分为3种基本的类型: 类型I PKS、类型II PKS和类型III PKS^[11]。

一般类型I PKS是有多个模块组成的多功能酶，每一个模块有一系列非重复的酶功能域构成，每一个酶功能域完成相应的催化反应；每一个模块催化完成一个二碳单位的延伸，模块中各功能域组成的多样性决定PKS合成产物的多样性。此外，类型I PKS还包括重复利用类型I PKS，主要参与真菌多聚酮的合成，Ahlert等^[12]从Micromonospora echinospora sp.中克隆合成calicheamicin 的PKS基因簇，有KS、AT、DH、和ACP功能域构成，在序列上与I型PKS有同源性，证明该PKS酶为重复体I型PKS。另外，Cheng^[13]等从S.atroolivaceus克隆了leinamycin的合成相关合成酶PKS基因簇，发现该酶缺少同源的AT功能域。从而发现新的I型PKS，在PKS的模块之外有离散的AT酶，能重复使用，为缺少AT的PKS各个模块转运丙二酸单酰CoA。

与其它类型的PKS显著不同的是，类型III PKS直接利用CoA的硫酯臂对中间体转运，各种脱羧、聚合、环化以及酯化等反应都是在同一个酶的同一个活性中心完成^[14,15,16]。

参考文献

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现在，SQR9的全基因序列测序已经完成，经分析得，序号为BAMSQR9-00630至BAMSQR9-00890为一个基因岛，经进一步预测，这个基因岛中含有与PKS合成相关的结构域，可能合成一种新型的聚酮合酶。我们的研究内容是利用高效液相色谱法对该PKS产生的聚酮类化合物进行纯化，并且利用质谱法、红外光谱及核磁共振等方法对其结构进行鉴定，最终得到该聚酮类化合物的具体结构，进而分析合成该化合物的PKS，以期获得基因方面的相关信息。

其中，拟解决的关键问题在于两点：第一，利用高效液相色谱仪对PKS进行分离和纯化;第二，找到适当的方法鉴定出聚酮类化合物的物质结构。

首先，利用双交换法对整个基因岛进行敲除，得到突变体。将野生型与突变体分别接到landy培养基中30℃，170rpm发酵68小时，4℃离心得到发酵液。将发酵液过大孔树脂柱，用甲醇浸提得到试验样品。接着，将样品进行高效液相色谱（HPLC）分析，找到野生型与突变体的差异峰并收集。然后，将经高效液相色谱仪收集的样品进行冷冻干燥，得到纯化产物。最后，利用质谱法、红外光谱及核磁共振等方法对其结构进行鉴定，最终得到该PKS产生的聚酮类化合物的具体结构。

本实验纯化和鉴定的物质是一种尚未被报道过的新型聚酮类化合物，结构、性质都是未知的，对该聚酮类化合物的纯化和鉴定能够更加完整地了解SQR9及其次级代谢产物。同时，值得我们注意的是，SQR9能够抑制同源菌株FZB42的生长，这一现象是否与SQR9中聚酮合酶产生的多聚酮有关，有待我们在分离纯化、及结构鉴定之后再从进化学、分子生物学等角度尝试更深层次地探索。

3月1日至3月5日，文献查阅，准备实验资料；

3月6日至3月15月，敲除SQR9相应基因岛；并收集发酵液；

3月16日至5月1日，筛选合成PKS的基因片段；

5月2日至5月5日，利用HPLC/TLC收集差异峰；

5月6日至5月10日，利用MS进行质谱分析，确定该新型聚酮合酶的结构；

5月11日至5月25日，进行实验的相关总结以及毕业论文的撰写；

5月26日至6月1日，准备并完成毕业答辩。