浒苔和缘管浒苔矿质营养、渗透调节对海水响应开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

1.研究背景及意义

2008年黄海中南部海域出现迄今为止世界上最大规模的绿潮爆发，是我国沿海生态灾害史上的重大事件（liu等,2009）。从此，中国沿海除了赤潮之外又频频出现了另一类重大的海藻灾害―浒苔大型藻绿潮。由绿藻引起的绿潮爆发在世界范围的港湾、河口已屡见不鲜，早在20多年前，欧洲就爆发了绿潮灾害，灾害范围和规模随着沿岸海域污染加重而不断扩大（kamer和fong,2000）。近10多年来，在美国、加拿大、丹麦、荷兰、法国、意大利、日本、韩国和菲律宾等国家沿岸海域，均爆发过绿潮灾害，已逐渐成为世界性的海洋环境与生态问题，引起各国人士广泛的关注（唐启升等,2010）。近年来，绿潮的发生频率和其生物量总体呈明显的上升趋势。美国学者将大型藻藻华发生作为富营养化评价的一个指标（bikowski等,2007）。

　为了进一步研究浒苔爆发机制，需要研究其栖息地的环境特征以及其适应环境的机制，浒苔生活在盐度变化较大的潮间带，以及盐度较小的河口地区，其耐受盐度变化的能力很强，而渗透调节是海洋藻类的重要抗逆生理机制之一，其矿质营养和溶质组成对不同盐度的海水具有不同响应机制从而进行生理调节以适应环境变化。研究石莼属植物浒苔和缘管浒苔对不同盐度的响应有利于对海水富营养化进行预防和治理。

2. 研究的基本内容和问题

1.研究内容

　本试验通过设置不同水平的海水浓度对漂浮浒苔、固着浒苔和缘管浒苔进行处理，观察其无机离子含量、有机溶质含量及其渗透调节能力的变化，阐明不同浒苔品种对盐胁迫的生理响应机制。

2.研究目标

3. 研究的方法与方案

1.研究方法

　（1）Na 、K 、Ca2 、Mg2 和Cl-含量的测定

取一定量处理10d的样品杀青、烘干、磨碎、过筛（30目）。参照郑青松等（2003）方法，称取干燥样品50mg，采用HNO3-HClO4法进行消化（二者体积比为4:1），消化完成后用蒸馏水定容至50mL，利用电感耦合等离子体光谱发生仪（ICP）测定样品中Na 、K 、Ca2 、Mg2 的含量，Cl-的测定采用AgNO3滴定法，每个处理设3个平行样。

　（2）N和P含量的测定

取一定量样品杀青、烘干、磨碎、过筛（30目）。参照鲍士旦（2000）方法，称取一定量干样，H2SO4-H2O2消煮，消化完成后用蒸馏水定容至50mL，稀释一定倍数后用流动分析仪测定N含量；利用电感耦合等离子光谱发生仪（ICP）测定P含量，每个处理设3个平行样。

　（3）可溶性糖（SS）、可溶性蛋白（SP）、脯氨酸（PRO）、游离氨基酸（FAAS）和有机酸（OA）含量的测定

　SS含量的测定采用蒽酮比色法（李合生等,2000）测定。取一定量的样品烘干、磨碎、过筛（30目），称取0.2g干样，放入到带刻度的试管中，然后加入10mL蒸馏水，密封试管口，在沸水浴中提取30min（提取2次），将提取液过滤到25mL容量瓶中，反复冲洗试管及残渣，然后定容至刻度。吸取容量瓶中样品提取液1mL加入到20mL的具刻度试管中，加1mL蒸馏水，0.5mL蒽酮乙酸乙酯试剂和5mL硫酸，充分振荡混匀，立即放入沸水浴中，1min后取出，自然冷却至室温，以空白作对照，在630nm波长下测吸光度值，由标准线性方程查出糖的量，再计算叶片样品的糖含量。每个处理设3个平行样。

SP含量的测定采用考马斯亮蓝G250法（李合生等,2000）。称取处理后的藻体0.5g，用5mL蒸馏水或磷酸缓冲液（0.1molL-1，pH=5.8）充分研磨成匀浆后，3000rpm离心10min，然后取上清液1mL，加入考马斯亮蓝G2505mL，充分混合，放置2min后在595nm波长下测吸光度值，计算SP含量。每个处理设3个平行样。

　PRO含量的测定采用茚三酮比色法。取一定量样品烘干、磨碎、过筛（30目），称取0.2g干样，分别置于试管中，然后向各试管分别加入5mL3%的磺基水杨酸溶液，在沸水浴中提取10min（提取过程中经常摇动），冷却后过滤于干净的具刻度试管中。吸取2mL提取液于另一个干净的试管中，加入2mL冰醋酸及2mL酸性茚三酮，混合均匀后置沸水浴中30min，溶液即呈现红色。冷却后加入4mL甲苯，振荡30s，静置片刻，取上层液到10mL离心管中，3000rpm离心5min。用吸管轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液，在520nm波长下测其吸光度值，并计算其含量。每个处理设3个平行样。

　FAAS含量测定采用茚三酮溶液显色法。取一定量样品烘干、磨碎、过筛（30目），称取0.5g干样于研钵中，加入5mL10%乙酸，研磨成匀浆后，在使用蒸馏水精确稀释至100mL。混匀，并用于滤纸过滤到三角瓶中备用。吸取样品过滤后的滤液1mL于20mL试管中（试管干燥），之后加蒸馏水（无氨）1mL，以及3mL水合茚三酮，抗坏血酸0.1mL。混匀后封口，置于沸水浴中加热15min，取出后使用冷水迅速冷却并且不断的摇动，从而使加热时形成的红色被空气逐渐被氧化后褪去，随后呈现蓝紫色，用60%的乙醇定容到20mL。在570nm波长下测定期吸光度值，并计算含量。每个处理设3个平行样。

OA含量采用NaOH滴定法测定。取一定量样品烘干、磨碎、过筛（30目），称取0.2g干样放入大试管中，加入20mL蒸馏水，于80℃恒温水浴中浸提30min，不断搅拌。过滤到50mL容量瓶中，定容至刻度。取10mL提取液，加入2~3滴酚酞指示剂，用0.1molNaOH标准液滴定至浅粉色不退为止。记录滴定用去的NaOH毫升数，计算其含量。每个处理设3个平行样。

（4）渗透调节能力（OAA）的测定

OAA的测定参照李德全等（1992）和Zheng等（2010）方法。取不同处理的浒苔取出后清洗表面盐渍，用吸水纸吸净表面水分，然后在去离子水中浸泡4h，待饱和后，立即放入液氮中浸泡30min，取出后置于医用注射器中，室温下放置30min融化后，挤出汁液收集到离心管中，用FM-8P型全自动冰点渗透压计（上海医大仪器厂生产）测定并计算饱和渗透势。Δπ100=，式中：为对照试验材料组织的饱和渗透势；为海水处理下试验材料组织的饱和渗透势。每个处理设3个平行样。

2.技术路线

3.实验方案

试验材料漂浮型浒苔采自江苏省南通市启东县启东海域，固着型浒苔采自江苏省大丰市海涂，缘管浒苔采自江苏连云港连岛海域。将采回的漂浮型浒苔、固着型浒苔和缘管浒苔使用人工海水冲洗干净，除去杂藻、贝壳等杂质，选取生长状态较好的藻体放入500mL三角锥形瓶中暂养5d以适应实验室的生长环境，锥形瓶中含已灭菌的加入VSE培养液的人工海水（33.33psu）培养液（1L海水加入1mLVSE母液）。5d之后称取长势相同的藻体（称量时用滤纸吸干藻体表面的水分）转入250mL三角锥形瓶中，每瓶放置0.5g藻体，设置6个处理，每瓶含200mL人工海水培养液（在VSE培养液中加入不同质量的固体海盐，形成稀释或者浓缩的海水处理液，使用电导仪测定电导值）。盐度分别为0psu（对照）、3.33psu（10%海水）、16.66psu（50%海水）、33.33psu（100%全海水）、66.66psu（200%海水）、99.99psu（300%海水）。培养过程和处理过程均在GXZ型智能型光照培养箱中进行，温度（201）℃，光照度4500~6000Lx，光:暗周期为12h:12h，pH值为8.0。每隔1d更换1次处理液，每个处理设置3个重复，10d后取样测定。盐度为33.33psu的人工海水（江苏海域全海水，即100%海水）。

表1VSE培养液母液

Table1VSEculturesolution(gL-1)

表2供试人工海水成分主要离子含量（矿化度为33.3）

Table2Contentsofbasicionsinseawatersample(mmolL-1)

4.可行性分析

（1）有长期从事海洋生物学研究的专业指导老师指导。

（2）本课题组长期从事植物营养学、海洋生物学和中国沿海滩涂开发研究，是江苏省海洋重点开放室和国家重点学科农业资源与环境的主要组成部分，已有大量投入，也是学校211重点建设学科的一部分。

（3）研究条件良好，常规仪器设备齐全。

4. 研究创新点

特色和创新之处

近几年由于沿海绿潮爆发，国内外专家对其进行了多方面的研究，目前关于石莼属浒苔的研究主要集中在盐度、温度、光照、营养盐、重金属、pH值等生态因子对石莼各品种生长代谢的影响，及其生活史和营养成分的分析等，而关于不同石莼属品种耐盐性的比较的文献报告较少。因此，以不同品种的石莼属植物为材料，研究其不同浓度海水胁迫下的生长、生理特征的变化，比较其耐盐性，并阐述其相关机制，这一研究具有鲜明的特色和创新性。

5. 研究计划与进展

1.试验进度安排

2014年3月1日3月25日准备材料并对不同品种浒苔进行采集和培养。

2014年3月26日5月10日用不同盐度的海水进行处理，选取供试材料对其各个指标进行分析测定，得到数据进行初步处理。