光质对烟草幼苗侧根生长发育的影响开题报告

研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析

实验方法

1.材料准备

本研究使用的烟草品种是K326。种子发芽使用的培养基是泥炭和蛭石按体积比1:1混合成的固体培养基，并放入温室中以自然光照培养，日夜温度控制在28C/22C。将生长25天、大小活力一致的幼苗放入液体培养基（培养基盖上有10孔，每孔插入一棵幼苗），培养液使用四分之一浓度的霍格兰营养液。营养液每天更换并保证其pH为6.0。在移入液体培养基后，将幼苗放入三个密室中，每个密室有可以发出红、白、蓝三种光之一的LED灯。在实验开始前，每个培养基用铝箔将四周严实的包好，防止透光。所有处理每天光照16小时，暗培8小时，每个处理有12个重复。设置包括在随机区组设计，以避免边缘效应。烟草植株在12天的时间里分批收割，然后将

植物样本速冻并放置在-40℃冰箱保存，以确定IAA含量和基因相对表达水平。

通过植物生长媒介向植株施加外源NAA和生长素传导抑制剂NPA，将25天大的幼苗放置在含有NAA或NPA的液体培养基中培养12天。

2.根系结构测量

虽然烟草是双子叶植物，但主根不发达。我们观察到水培处理后一级侧根和二级侧根发育明显，但主根没有变化。因此选择观测光质对侧根的影响。一级侧根的测量使用直尺，二级侧根平均长度通过有图像分析系统的WinRhizo扫描仪测定。侧根数量通过人工计数获得。二级侧根数与一级侧根长度的商即为二级侧根密度。

在确定鲜样重量之后，将其迅速放入液氮中冷冻。游离的IAA通过高效液层析法测定。测定后比对标线确定浓度。

3.GUS组织定位实验

DR5和烟草自身GH3启动子有着同样强烈的生长素响应。在观测之前，烟草先用乙醇去除叶绿素。脱色的组织用带有彩色CCD照相机的OlympusSZX2-ILLK立体显微镜拍照。

4.[³H] 标记的IAA 运输试验

在根茎结合处上方2厘米处将茎切断，在断面处施加20 L[³H]标记的 IAA溶液，并将其暗培18小时。随后挑选十组重复作为样品并称重，随后根部样本放入闪烁液中浸泡18小时以上。[³H]标记的 IAA的放射性测量通过BeckmanCoulter LS6500多用途的闪烁计数器测定。

5.定量反转录聚合酶连锁反应（qRT-PCR）分析

NtPIN1 、NtPIN1b、NtPIN3、NtPIN3b、NtPIN4、NtPIN9载体的转录水平与稳定的参照基因NtL25相比较。在不同光质下培养12后，将烟草幼苗根茎结合处所有RNA 提取出来。因为有些PIN基因过于相似，我们首先手动测试这些引物，然后利用Primer 5软件验证。实验有三组对照。

6.数据分析

对数据以汇总的方式计算标准误差（SE），然后进行单向方差分析，其次是LSD多重比较试验检测两两显著性差异（P＜0.05之间）。采用SAS 9.2软件对所有的数据进行统计分析。

可行性分析

（1）工作积累：项目所在的植物营养分子生物实验室具备长期从事植物营养相关的基本实验操作基础，在主要实验方法和测定项目方面具备丰富的经验。

（2）学生素质：本人来自资环专业，专业知识牢固，对科研具有浓厚兴趣，刻苦学习精神可以保证在短期内掌握实验需要的操作技术。

总之，本项目研究目标明确、研究内容集中，是申请者所在课题组老师前期研究的拓展。植物营养分子生物实验室是国家重点学科植物营养学建设的实验室，实验条件完全能满足本项目的需求。