番茄青枯病拮抗菌的分离筛选及生物学特性研究开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

1、本课题的意义

青枯病是番茄、马铃薯、辣椒、茄子等多种茄科蔬菜的一种毁灭性土传病害,广泛分布于热带、亚热带以及部分温带地区。番茄细菌性青枯病由茄科劳尔氏菌引起^[1][2]，是我国长江流域及以南方各省市及台湾地区番茄生产中最为流行的植物病害之一^[3]，尤其在设施番茄生产上发病严重，发病主要症状是番茄植株迅速萎蔫、枯死。防治青枯病的方法主要有培育抗性品种、喷施化学农药以及生物防控等。但是抗性育种培育周期过长，需要大量的人力物力。由于不同地区可能存在不同的致病型病原菌，需要培育适合本地区的抗病品种，因此目前市场上的部分抗病品种得不到大范围的推广。另一方面，一些抗病品种经过几年种植后其抗病性显著下降。而且一些抗病品种呈现不良的经济性状（如食用品质下降）。因此，目前真正用于生产的抗病品种较少。施用化学农药是农户普遍接受的防治植物病害的方法。目前市场上可用于防治土传病害的主要是一些广谱性杀菌剂，如百菌清、多菌灵、双效灵、施宝灵、强氯精、dt粉剂、可杀得、抗枯宁等，但防治效果不甚理想，且容易使病菌产生抗药性。另外，化学药剂的使用将带来严重的食品安全问题和对土壤生态的破坏，蔬菜上的农药残留严重超标，将严重危害人们的身体健康。另外，青枯病为土传病害、病原菌变异大、寄主范围广,因而防治较为困难。与之相比，生物防治具有无污染、无公害、对人畜毒性低及环境压力小等优点，是一条安全有效的防治途径，符合有机农业、生态农业和可持续农业发展的要求。拮抗细菌是能够抑制病原菌生长的有益微生物。近年来研究表明,植物体内存在大量对植物病害具有较好防治作用的内生细菌,尤其是对化学药剂难以发挥作用的植物土传病害、维管束病害和系统性病害的防治更显示其独特的优势。近几十年来国内外对青枯病的生物防治途径进行了广泛的研究，并取得了较大的进展^[4,5,6]。但挖掘新的高效拮抗菌资源仍然十分必要，是开展生物防治的前提，对防治番茄青枯病具有重大意义。

2、国内外研究概况

目前，已有大量利用生防菌防控青枯病的报道，主要的微生物资源包括有假单胞菌（pseudomonasspp.）、芽孢杆菌（bacillusspp.）、链霉菌（streptomycesspp.）和菌根真菌（mycorrhizalfungi）等^{[7,8,9,10,11,12]。}假单胞杆菌属(pseudomonas)细菌通常能在植物根围土壤中大量增殖，可在适宜的植物体外和自然条件下产生噬铁素，不少菌株还可以产生抗病的次生代谢产物。假单胞菌作为生防因子主要集中在荧光假单胞菌(pseudomonasfluorescens)、恶臭假单胞菌(pseudomonasputida)、洋葱假单胞菌(pseudomonascepacia)这3个种上，其中荧光假单胞菌是最重要的生防细菌之一，芽孢杆菌可以产生芽孢，抗逆能力强，繁殖速度快，营养要求简单，易定殖在植物表面，芽孢杆菌产生的芽孢有利于生防制剂的生产和储存^[13]。因此，芽孢杆菌的利用是拮抗细菌研究中的重点和热点。许多芽孢杆菌不仅对病原菌有拮抗作用，还对作物具有促生作用，所以受到厂家和农户的青睐。目前研究和应用较为成熟的种类有枯草芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌等。芽孢杆菌作用机制包括竞争作用、拮抗作用和诱导植物抗病性等。印度anuratha等用两株芽孢杆菌菌株b33和b36防治香蕉、茄子和番茄青枯病，分别取得了温室盆栽试验50%、61%、95%和田间试验50%、49%、36%的防效。黎起秦等从广西5个县市采集的标本中共分离到55个细菌菌株，其中以芽孢杆菌出现的频率最高，占56.4%，效果最好的也是芽孢杆菌b47，在防治番茄青枯病的试验中，发现接种b47菌17d后再接种茄青枯雷尔氏菌的植株能较好地防治番茄青枯病，防治效果为81.25%。不过，直接接种到根际的拮抗菌由于与大量的土著微生物竞争空间和营养，往往不能有效在根际定殖，防效有限^[14]。因此，有学者将生防菌株与相适应的有机载体相结合以保持其稳定的定殖，且能为植物生长提供一定的营养^[15,16]。

3、应用前景

对番茄青枯菌生物防治的研究，尽管国内外取得不少进展，但生物防治的方法目前大都处于理论和试验阶段，进入实际生产的很少。利用无致病力青枯菌菌株、拮抗细菌等方法对青枯病都能在一定程度上起到防治作用，但在田间条件下的防治效果却不太稳定^[17]。分子生物学的发展为番茄抗青枯病病理及育种研究提供了新的途径和方法。分离筛选理想有益的生防菌在田间使用，适应不同环境，从而有效控制青枯病的发生和流行。随着基因工程技术的日趋成熟，克隆拮抗微生物的功能基因、研究拮抗基因的表达调控、构建高抗高控生物工程菌株，进而研制高效稳定的生防制剂，已成为植物病害生物防治工作的研究热点。

2. 研究的基本内容和问题

1、研究的目标

筛选出一株对番茄青枯菌具有显著拮抗作用的微生物菌株，研究其生理生化特征及其产生拮抗作用的最佳条件，并将其应用于番茄生产，降低番茄青枯病的发生率。

2、研究内容

（1）拮抗菌的分离、筛选

3. 研究的方法与方案

1、研究方法

利用平板对峙初筛、牛津杯复筛的方法，从土壤中分离筛选拮抗菌；根据生理生化特性和16srrna基因序列分析进行鉴定；利用hplc-ms技术分离鉴定拮抗物质；利用温室盆栽试验进行番茄青枯病的生物防治。

2、技术路线

3、实验方案

（1）拮抗菌的分离：

采用稀释平板法分离出具有拮抗能力的菌落，将土壤稀释液涂布在lb平板上，在30℃培养2天，待菌落出现。然后将病原菌菌悬液喷在培养皿上，继续培养24小时，菌落周围有拮抗圈的即为拮抗菌。

4. 研究创新点

分离拮抗菌大多数是根据拮抗圈的大小来进行的，但很多在实验室条件下拮抗能力很强的菌株在土壤中的应用效果并不理想，关键在于其在土壤和植物根际的定殖能力弱造成的。

因此，本项目在筛选高效拮抗菌时根据，不仅根据其拮抗能力，而且还从生长速度、营养利用能力，尤其在番茄根际的定殖能力来综合考虑，这样筛选出的拮抗菌当用于土壤中的，预期会获得很好的应用效果，这是本项目的创新之处。

5. 研究计划与进展

1、2016年3月-2016年4月

（1）拮抗番茄青枯菌的生防菌株分离筛选

（2）拮抗菌株的的筛选与鉴定