一种SQR9生物有机肥增强剂的研制开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

一：研究的目的与意义

1：农业固体废弃物资源化利用。

本实验以中药萃取后的物料（简称中药渣）、烟丝生产下脚料（简称烟沫）、真菌类产品生产后废弃物（简称菌糠）为原料，试图解决中药渣、烟沫、菌糠此类生产废弃物由于随意堆放带来的地域侵占，环境气味恶劣等不良因素，也为实现资源的有效利用。

2. 研究的基本内容和问题

一：研究目标与内容

1：制备沼液

确定利用中药渣、菌糠、烟沫固体废弃物进行厌氧发酵制取沼液的最佳含水量、最佳接种量、发酵最佳ph、最佳发酵温度等条件。

3. 研究的方法与方案

一：研究方法

沼液制备利用单因素试验、正交试验进行；

沼液促进效果验证利用趋化实验验证；

SQR9菌株观察通过稀释涂布以及SQR9-gfp进行；

根际定殖及数量通过水培实验验证；

二：实验方案

1：沼液制备

1.1种泥驯化

接种物选择消化污泥（污水处理厂），接入量以10%（w/w）进行，含水量85%，发酵温度设为35℃，调整pH为5.0，发酵过程检测pH变化，待pH降至最低点作为发酵完成时间，如此反复进行三次，将第三次发酵底物作为扩大培养接种物。

1.2单因素试验

1.2.1：确定最佳含水量

接种物为10%，pH为5.0，温度为35℃，含水量设为80%、85%、90%、95% 共4个梯度，进行厌氧发酵。

1.2.2：确定最佳pH

采用最佳接种物，最佳含水量，温度为35℃，pH设为5.0、6.0、7.0、8.0共4个梯度，进行厌氧发酵。

1.2.3：确定最佳发酵温度

采用最佳接种物，含水量，pH，发酵温度设为30、35、40、45共4个梯度，进行厌氧发酵。

1.3正交实验

根据单因素试验确定的最佳参数值，设计正交试验，找到厌氧发酵的最佳组合。

2：水培实验

准备实验：准备三个组培瓶，洗净装1/3蛭石；40个50ml三角瓶洗净，用封口膜封好，两个培养皿和若干滤纸；大量棉花，用报纸包好。灭菌。取2ml次氯酸钠溶液加入100ml水配成2%的次氯酸钠溶液，次氯酸钠在通风橱中取，现配现用。取75ml乙醇加入量筒用自来水定容至100ml即为75%乙醇。提前准备一瓶无菌水。

2.1 取温水，大约60℃，对种子进行浸种，大概4~6h，可放在培养箱使温度降低缓慢，中途可加热水使其保持恒温；

2.2 在超净台中，使用2%的次氯酸钠对种子进行杀菌，约2min，再用75%的乙醇，洗去种子外面的杂质；最后，使用无菌水，洗净种子；

2.3 在超净台中，将滤纸放入培养皿中，用无菌水润湿，注意不要有水流浸出，如有可以在超净台上吹一下，之后将种子均匀的摆在滤纸上，28℃左右培养至出芽。

2.4 准备已经灭过菌的蛭石，向里面倒入适量的无菌水，注意最后不要形成水流，不能太湿；

2.5 用灭菌的镊子，夹取种子于无菌的蛭石中，根朝下，轻轻用蛭石覆盖种子，避免光照强烈刺激；

2.6 放入光照温室，培养，至苗长至接触到瓶盖；

2.7 移苗到无菌的50ml三角瓶中，继续培养至长出2~3片新叶，可以换100ml三角瓶培养；

2.8 选出一批生长良好的实验材料，黄瓜9棵（考虑设置3个菌终梯度）；

2.9 与此同时，试管摇菌（SQR9-Gfp）,至OD600=1.0，1%的接种量转接到500ml三角瓶中，于37℃，170rpm/min,摇至OD600=1.0，离心收集菌体，并用无菌的1/4MS（1倍的培养液生长效果不好）营养液洗涤3次，最后重悬于1/4MS营养液中备用；

2.10 对照：接SQR9-Gfp，至终浓度OD600=0.1，在缓慢震荡条件下培养以保持菌体浮游生长；

2.11 按照5,10,15,20倍的沼液稀释浓度，将沼液添加至锥形瓶中。

2.12 培养3~5天之后，将根用无菌水轻轻冲洗，并用吸水纸吸干后，再将根剪下来，称重后，于无菌的研钵中，磨碎后，稀释涂布计数；

相同处理，不同苗，分别称0.2克根。

或者：

培养3~5天后，将根用无菌水反复、轻轻冲洗，然后，将苗放到装有适量无菌水三角瓶中，放至超声仪中震荡，将根表定殖形成生物膜的菌尽可能洗脱下来，12000g，10min，离心收集菌体，将收集的具体稀释成10^-4、10^-5、10^-6，涂布于Km20μg/ml的平板上，37℃过夜培养，并对根称重。

2.13 涂布：

每棵苗，选择10^-2、10^-3、10^-4，各3个重复，共3棵*3种稀释倍数*3个重复=27个。

3：肥料验证

将发酵菌液的添加量设定为10%，15%，20%三个梯度，具体做法为：将菌液（包含固体）添加至发酵完成的生物有机肥中，混匀，放置7天，期间每天观察温度并进行涂布计数，激光共聚焦显微镜 (confocal laser scanning microscopy，CLSM)下观察SQR9-gfp的存活情况。

三：技术路线

见附件

四：可行性分析

1：沼液的促进效果

沼液是人、畜粪便及农作物秸秆等各种有机物经厌氧发酵后的残余物，是一种优质的有机物。厌氧发酵一般理论分为三个阶段：水解，产酸以及产甲烷阶段。产酸阶段是水解阶段的有机物在胞外酶的作用下转化为小分子化合物，如低级脂肪酸、醇、酮、醛等物质的过程。厌氧发酵过程中多菌群共生作用使得厌氧发酵液成分复杂，含有多种生物活性物质。研究表明，其中大概包含有三类物质。一是易被作物吸收的小分子营养物；二是离子形态的营养元素；三是包含有氨基酸，生长素，赤霉素，不饱和脂肪酸等物质的，目前尚未完全清楚的，称为生物活性物质。

沼液含有丰富的营养物质，经调配可培养微生物并获取高价值产品，如养殖藻类获取生物质、培养絮凝菌获取生物絮凝剂、培养光合细菌制氢等。从以上资料可看出，利用沼液从事添加剂研发从理论上和实践上均有相关内容。

2：相关指标分析

实验中重要的两个指标一是VFA含量，二是SQR9菌株计数。对于VFA含量测定，实验拟通过比色法测定。原理是含挥发性脂肪酸的样液，在加热的条件下，与酸性乙二醇作用生成酯，此酯再与羧胺反应，形成氧肟酸。在高铁试剂存在下，氧肟酸转化为高铁氧肟酸的棕红色络合物，其颜色的深浅在一个较大的范围内与反应初始物挥发性脂肪酸的含量成正比，故可用比色法测定。

SQR9计数采用本实验室中已经构建完成的SQR9-gfp菌株进行。

携带含在HpaⅡ启动子控制下表达GFP的大肠杆菌－芽孢杆菌多拷贝穿梭质粒pHAPⅡ(GenBank登录号HM151400)的SQR9菌株，记为SQR9-gfp。该菌株在荧光显微镜下能发出明亮的绿色荧光，其生长速度和代谢特性与野生型基本相同，质粒传代稳定性好。

3：实验材料

对于厌氧发酵以及水培实验，本实验室均具备相关器材及设备，用于完成实验内容。

4. 研究创新点

1：现有的沼液应用研究建立在沼气发酵的副产物基础上，将其主要作为作物追肥的一种类型或杀虫剂制作原料进行处理，本研究根据沼液研究中的生物活性物质特点，控制农业固体废弃物厌氧发酵产酸阶段，将沼液作为主要产物，探究其作为一种添加剂对生物有机肥施用效果的影响。

2：利用固体资源作为底物进行厌氧发酵，在发酵过程中通过对发酵条件的约束，使发酵停留在产酸阶段，并通过其它发酵条件的优化，控制产酸的稳定进行，是一条适应可持续发展要求的途径。不仅可以充分利用固体废弃物中的有机物，同时还得到了具有经济价值的产品，实现了废弃物的资源化。

5. 研究计划与进展

1:2016.072016.09：烟沫、菌糠、中药渣的c/n、含水率、底泥，厌氧发酵实验，产酸阶段指标探索、适宜含水率、温度探究，发酵过程ph测定，挥发性有机酸测定等内容；

2:2016.092016.11：继续厌氧发酵过程、厌氧发酵产物进行堆肥、sqr9菌株数量测定、发芽实验、水培，确定适宜的稀释比率。

3:2016.112016.12：厌氧发酵阶段的进一步探索，确定适宜的ph、含水率、温度等。进行相关资料整理。