温度对根际细菌互作关系的影响研究开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

青枯病是由茄科劳尔氏菌ralstonia solanacearum引起的一种寄主广泛的土传病害，能侵染大部分茄科植物，我国最重要的蔬果之一番茄也不能避免被这种病原菌侵染。

发病时植物大面积萎蔫，产量大幅下降，对农民的生产生活造成了巨大的负面影响[1]。

为了更好地防治青枯病害，研究者对其发病机制和影响因素进行了多方位的探究往往具有很大的实用价值。

2. 研究的基本内容和问题

（一）目标：（1）研究实验室培养条件下HR69对青枯菌生长的促进作用效果、T-5对青枯菌的抑制作用效果；（2）探索不同温度分别对RS、HR69和T-5生长的影响（3）探索不同温度下HR69对RS生长促进效果的变化趋势以及T-5对RS抑制效果的变化趋势（二）内容：（1）不同温度梯度下RS、HR69和T-5的生长状况（2）30℃时HR69和T-5对病原菌RS的作用（即HR69对病原菌生长的促进作用和T-5对病原菌生长的抑制作用）（3）不同梯度温度分别对HR69与RS关系及T-5与RS关系的影响（即RS数量的变化，是否还是促进或抑制）（4）同一温度不同时间段HR69对RS生长的促进状况（三）拟解决的关键问题：（1）微孔板培养系统细菌区系的人工构建（2）温度梯度的合理设置（3）不同处理中Rs生长状况的指标建立

3. 研究的方法与方案

（一）研究方法（1）采用微孔板共培养系统测定两株菌对青枯菌的抑菌能力，设置不添加两种菌的对照（2）采用微孔板系统法研究hr69和t-5对青枯菌的不同影响。

该系统主要由以下4个部分组成：（a）培养基：该系统所用培养基是改良na培养基（b）接种细菌（群落）：即接种 hr69或t-5或病原菌（红色荧光标记菌株）悬液，hr69和t-5初始接种量为od600=0.7，浓度为1%，rs初始接种量为od600=0.5，浓度为1%；（c）震荡培养：控温摇床，设置孔板的温度梯度，培养温度分别为15℃、20℃、25℃、30℃和35℃，转速为170r/min，培养时间分别为36h、48h、60h、72h；（d）测od600和红色荧光强度：即在培养到36h、48h、60h和72h时用酶标仪检测群落的od600和红色荧光强度（发射光：587 nm，吸收光：610 nm）；（二）技术路线（三）实验方案（1）青枯有益菌在不同时间中对青枯菌数量变化的影响实验在在南京农业大学资源与环境科学学院微生物资源收集实验室内进行。

甘油管保存的青枯菌在含有庆大霉素30μg/ml的na培养基上活化，hr69在改良na培养基上活化；活化后的菌种接种在3ml改良na培养基的试管中培养至对数期，培养条件为170 r/min，其中培养青枯菌的试管应当加入终浓度为30 μg/ml的庆大霉素；将对数期的菌株取出，分别在5800 r/min下离心3 min，用无菌水制成菌悬液，调节青枯菌悬液的od600值为0.5，调节hr69的od600值为0.7，接种到48孔板中，实验处理如下表所示：处理编号 rs/μl hr69/μl 培养基/μl1 2 0 1982 0 2 1983 2 2 198将构建好的微孔板区系放在30℃的摇床中培养，分别在36h、48h、60h和72h时测定每个处理的抑菌率，并取样稀释涂布，计算rs和hr69的数量。

4. 研究创新点

本研究以不同于以往直接在青枯菌拮抗菌中寻找对抗青枯病的机制的视角，从青枯菌有益菌入手，探索在不同进程、不同区系组合下对青枯菌的生长状况的影响，希望能为之后揭示出青枯菌有益菌促进青枯菌生长的深入机理提供帮助，为开发出新的防控手段打下基础。

5. 研究计划与进展

（一）研究计划2016.12-2017.01 查阅文献资料，准备实验材料，学习基本实验操作技术；2017.02-2017.05 青枯有益菌在不同时间中对青枯菌数量变化的影响实验；不同温度梯度下人工构建的细菌区系对青枯菌的生长状况的影响实验；2017.05-2017.06 数据分析，攥写论文，课题总结并进行论文答辩。

（二）预期进展（1）实验室从感病植物根际获得了HR69和T-5，室内实验证明HR69对Rs有明显的促进效果，T-5具有明显的抑制效果；（2）以单因素变量原则构建人工细菌区系，即实验的不同处理；（3）完成青枯有益菌在不同时间中对青枯菌数量变化的影响实验；（4）不同温度梯度下人工构建的细菌区系对青枯菌的生长状况的影响实验；（5）完成本科毕业论文1份；（6）预期发表论文1篇。