根际有益菌专一噬菌体的筛选与鉴定开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

意义：由茄科雷尔氏菌（ralstonia solanacearum,简称青枯菌）引起的植物细菌性青枯病是一种世界范围内普遍发生的重要土传病害。

其能够侵染多个科的多种植物,其中包括许多重要的农作物,如番茄、马铃薯、烟草、辣椒、茄子、花生、香蕉、桑树、按树、油橄榄等。

植物青枯病的防治历来受国内外科学家的高度重视,国际上每年举办一次细菌青枯病学术研讨会,对其进行广泛而深入的讨论和交流。

2. 研究的基本内容和问题

研究的目标、内容和拟解决的关键问题目标：从土壤中分离、筛选得到解淀粉芽孢杆菌T-5、荧光假单胞菌CHA0、F113、Phl1C2、Pf-5、Q2-87、Q8R1-96、1M1-96、MVP1-4共9株生防菌的噬菌体，并进行鉴定。

内容：1. 分别通过筛选、分离、纯化获得9株噬菌体2. 进行鉴定拟解决的关键问题：如何从土壤样品中得到噬菌体

3. 研究的方法与方案

研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析研究方法：采用菌液富集过滤的方法分离得到噬菌体技术路线：1.噬菌体悬液制备2.生防菌噬菌体富集3.方形平板检测噬菌体侵染能力4.进行鉴定 实验方案（以分离一株生防菌噬菌体为例）：噬菌体悬液制备：0.5g土 1.5ml水于离心管→涡旋离心（5800r 4min）→上清液200μl→96孔滤膜（1500r 3min）过滤→噬菌体悬液共190个土壤样品，得到190份噬菌体悬液生防菌悬液制备：甘油管→划线→培养2天→挑单菌落到试管里→摇12h至OD600＞0.5生防菌噬菌体富集：1.取5ml 生防菌悬液于圆型平板用无菌水调OD600为0.52.取其中的 2.5ml菌 50ml 1/2NA于方形平板3.取96孔板每个孔加190μl上述混合液4.取96孔板每个孔依次加噬菌体悬液10μl5.另取一块96孔板只有混合液，不加噬菌体悬液作为对照6. 放置于30℃170r摇床培养48h，10h开始每2小时测定DO600记录生长情况方形平板检测噬菌体侵染能力：1.3mlNA的试管里接菌，摇床培养12h2.150ml三角瓶里加100ml 固体1/2NA培养基3.把培养基凝固的三角瓶融化，冷却4.把试管里的菌液倒入1/2NA的三角瓶，混匀5.将三角瓶里的菌液倒入方形平板，吹干大约30min6.富集过的96孔板离心，将噬菌体和菌分离7.取上清液用96孔滤膜过滤，滤液为富集后的噬菌体悬液8.方形平板分为48格，依次点3μl噬菌体悬液，放培养箱培养9.观察是否有噬菌斑10.纯化噬菌体鉴定：用 λ噬菌体 DNA 提取试剂盒提取噬菌体的核酸，提取的核酸在 1TBE 的 0.5%琼脂糖凝胶中电泳， 100 V，110 min，观察结果并进行分析。

可行性分析实验室不久前发表在《Evolution》上的论文《Parasites and competitors suppress bacterial pathogen synergistically due to evolutionary trade-offs》也是用本方法分离筛选得到的噬菌体，因此可行。

4. 研究创新点

特色或创新之处农业上目前对噬菌体的研究主要在动物医学方面涉及噬菌体治疗的研究，对土壤中噬菌体的研究较少。

土壤中噬菌体的研究主要以寻找病原菌噬菌体为主，目的是直接用病原菌噬菌体防控病原菌。

在利用生防菌防治土传病害的研究中，有关生防菌-病原菌-植物-根系分泌物的相互关系是研究热点，而鲜有探究生防菌噬菌体对生防菌的影响的。

5. 研究计划与进展

研究计划及预期进展研究计划：2017年2月-3月 查找资料，阅读文献，做准备工作2017年3月-4月 先以T-5为材料做预实验，然后完成9株菌的全部实验2017年4月-5月 撰写论文2017年5月-6月 准备答辩预期进展：1. 获得9株专一的生防菌噬菌体2. 明确9株噬菌体生物学分类3. 获得噬菌体效价、一步生长曲线等生物学特性