1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
课题意义
环境雌激素能够通过扰乱生物体内天然雌激素的运输、分泌、合成、分解和代谢，影响生物生殖功能等功能，从而对生物体健康和种群繁衍产生严重影响。环境雌激素常在污水和畜禽粪便中富集，如何去除畜禽粪便中的雌激素进而实现无害化处理已经成为目前环保领域亟待解决的重大课题之一。
本研究采用海藻酸钠包埋法，将一株具有雌激素降解作用的功能菌株novosphingobium sp. ari-1制备成固定化菌剂，并对固定化条件进行优化；探讨在固定化菌剂对三种天然雌激素去除过程中，温度、ph、接菌量等因素对其降解效能的影响，以期将固定化菌剂实际应用到污水和畜禽粪便中的雌激素去除当中。
2. 研究的基本内容和问题
研究目标
1.通过制备获得固定化雌二醇（e2）降解菌剂。
2.通过正交实验获得高效e2降解菌的最佳固定化条件。
3. 研究的方法与方案
1 研究方法
1.1 固定化菌剂的制备
海藻酸钠包埋法：以海藻酸钠为包埋剂、CaCl2为交联剂，将海藻酸钠与E2降解菌菌悬液按一定配比均匀混合后，匀速滴入CaCl2溶液中，经过一定时间的交联获得具有相当弹性和硬度的固定化小球，用于后续实验的开展。
1.2 固定化条件的选择
四因子三水平正交实验：以海藻酸钠浓度、菌胶比、CaCl22H2O 浓度和交联时间作为试验因素，设计四因素三水平的正交表，以E2去除率为指标，综合分析后选择具备最佳E2去除效果和最佳E2菌剂成球效果的固定化菌剂制备条件。
1.3 环境条件对固定化菌剂降解三种雌激素效果的影响
研究温度、pH、接种量对固定化E2降解菌剂去除E2的影响，以E2去除率为指标，获得最适宜固定化E2降解菌剂发挥功能的外部条件。
1.3.1 温度的影响
反应温度设20、25、30、35、40℃ 共5个温度梯度。
1.3.2 pH的影响
MSM的pH值设4.0、5.0、6.0、7.0、8.0.共5个梯度。
1.3.3 接种量的影响
接入菌剂的量设50、100、150、200、250 g/L共5个梯度。
1.4 固定化E2降解菌剂广谱性分析
向同时含有E3、E2、E1的MSM培养基中接种固定化E2降解菌剂，以三种激素的去除率为指标，获得E2对三种雌激素的去除作，完成其降解动力学分析。
技术路线
3 实验方案
3.1固定化微生物小球的制备（见图1-1）
3.2 雌激素去除效率的测定
雌激素浓度测定采用定时整瓶提取培养基的方法。向培养基中加入等体积色谱甲醇，超声混匀，高速离心后过0.22 μm滤膜，用高效液相色谱法测定雌激素浓度。高效液相色谱（岛津LC-20AT）设定参数为：Inertsil ODS-SP-C18反相色谱柱（150 mm 4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈:水=70:30，流速1.000 mLmin-1，柱温40℃，紫外检测波长230 nm。
3.3 正交试验
试验条件有海藻酸钠浓度（A）、菌悬液与海藻酸钠的体积比（B）、CaCl2浓度（C）及交联时间（D）。由于所涉及的因素较多，为了能更科学地考察各因素之间的相互影响及各因素变化对固定化微生物性能综合影响，本研究采用了正交试验法。
根据表3-1选用了4因子3水平正交试验，各因子水平组合设计见表3-2。
表3-1 正交试验各因子水平
Tab.3-1 Factors and levels of orthogonal experiment
因子水平 | A因子 | B因子 | C因子 | D因子 |
海藻酸钠（%） | 菌胶比（v/v） | CaCl2H2O（%） | 交联时间（h） | |
1 | 3 | 1:1 | 3 | 4 |
2 | 4 | 1:2 | 4 | 6 |
3 | 5 | 2:1 | 5 | 8 |
表3-2 正交试验条件设计
Tab.3-2 Orthogonal experimental design
Table 2-2 Cross-test results of the removal of E2 by immobilized bacteria
实验编号 | 因 子 | |||
A | B | C | D | |
1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
2 | 1 | 2 | 2 | 2 |
3 | 1 | 3 | 3 | 3 |
4 | 2 | 1 | 2 | 3 |
5 | 2 | 2 | 3 | 1 |
6 | 2 | 3 | 1 | 2 |
7 | 3 | 1 | 3 | 2 |
8 | 3 | 2 | 1 | 3 |
9 | 3 | 3 | 2 | 1 |
注：K为同一因素E2去除率的合计值，R为E2去除率极差，单位均为%
4 可行性分析
申请者所在课题组长期从事土壤有机污染化学、有机污染的作物风险及模型、有机污染土壤生物修复技术等方面的研究，已取得的研究成果为本项目的顺利开展奠定了良好基础。
该项目指导教师曾长期从事环境有机污染化学和固废中污染物生物处理方面的研究；且本实验室已试验并完善了炔雌醇细菌的分离、筛选与鉴定的方法，完全不存在方法上的问题。
课题申请人来自资源与环境科学学院，专业知识全面，具有微生物学、无机化学、有机化学、环境化学等知识背景，专业基础良好，能够保证本项目顺利地开展和完成。
本项目课题所在实验室完全具备开展微生物试验所需的微生物室等实验场所，仪器设备齐全，完全可以满足本项目分析测试需要。
4. 研究创新点
目前我国对畜禽粪便的处理方法主要分为物理处理法、化学处理法、生物处理法。物理处理法又分为日光自然干燥、高温快速干燥、烘干膨化处理、热喷处理；化学处理法分为加热氧化、化学氧化、生物氧化；生物法分为厌气池发酵法、好气氧化池处理法、堆肥法。但这些传统方法存在成本高、能耗大、处理不彻底等问题。
我们研究的项目是利用功能微生物处理畜禽粪便中的雌激素等污染物，如果能发现一种适合大量投产的微生物，那么将有效解决传统畜禽粪便处理的能耗问题和处理效果不彻底的问题。另外，对功能微生物进行固定化能在一定空间提高微生物浓度，增强微生物活性和稳定性，使其表现出更高效的污染物降解能力。
5. 研究计划与进展
2017.01-2017.03
通过大量阅读中文和外文相关领域的文献对国内外相关领域的研究进展进行全面的学习和了解，完成文献综述。
2017.03-2017.04
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