解淀粉芽孢杆菌SQR9和突变体ΔysnE生物合成IAA相关的中间差异性物质分析开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

1、课题意义：解淀粉芽孢杆菌sqr9是从黄瓜根际分离的一种促生菌株，对黄瓜专化型病菌尖孢镰刀菌有很强的拮抗功能，在盆栽和大田实验中表现出了良好的促生和土传病害防控效果，其与腐熟堆肥制成的微生物有机肥在农业中有着广泛应用，所以研究解淀粉芽孢杆菌sqr9和其ysne突变体吲哚乙酸合成中间产物的比较分析能检测sqr9的促生因子，探索sqr9产生吲哚乙酸对促生的影响，及其吲哚乙酸的合成机制，对其在农业生产中的高效利用有着重要的意义。

2、研究进展：解淀粉芽孢杆菌sqr9是南农大沈其荣教授团队从黄瓜根际分离出来的一种菌株，至今已经有了很大的研究进展，主要有对sqr9与植物根系的互作研究，影响sqr9根际定殖的调控因子及其分子机制研究，sqr9的黄瓜促生和枯萎病生防效果及其作用机制研究，sqr9吲哚乙酸合成途径及促生效应的研究，以及sqr9固体发酵生产生物有机肥，研制复合型微生物肥料等。

3、应用前景：sqr9的液体，固体发酵能够生产研制出复合型生物有机无机复合微生物肥，且可以做为生防菌，对植物促生和土传病害防控有着很好的效果，所以研究其ysne突变体吲哚乙酸的中间产物能够对其吲哚乙酸的合成机制及吲哚乙酸对sqr9的促生影响有更深层次的探索,在生物防护和生物肥料高效化方面有着很好的应用前景。

2. 研究的基本内容和问题

1、研究目标和内容：本实验通过对解淀粉芽孢杆菌sqr9双交换法基因敲除，对野生型型菌株和突变体菌株Δysne进行生理生长比较，应用tlc和hplc技术进行分析比较其iaa产量及测定中间产物衍生物，测定生长曲线，分析中间产物的不同对Δysne促生效果的影响因素，得到比较分析结果。

解淀粉芽孢杆菌sqr9合成iaa主要以色氨酸为前提，其合成途径主要包括ian,tam,ipya和ysne基因参与的未确定途径。

其中，ysne基因敲除突变体合成的iaa仅为野生菌株的14%（shao et al.,2015a）,我们推测ysne基因是解淀粉芽孢杆菌中合成iaa的关键基因，其参与的合成途径是解淀粉芽孢杆菌iaa合成的重要途径。

3. 研究的方法与方案

1、 研究方法和方案（1）解淀粉芽孢杆菌sqr9双交换法基因敲除种子液接10 μl至新鲜的液体lb培养基(zeo 20 μg ml-1)中，37 c，170 r min-1培养至od 600 为0.5后，加入终浓度为0.5 %木糖相同条件诱导培养1 h。

将菌液以每管200 l的量分装到无菌的2 ml离心管中，加入8 l融合片段，37 c，150 r min-1复苏培养8 h后将菌悬液涂布于lb平板(zeo 20 μg ml-1，cm 5 μg ml-1)上，放于37 c培养箱中培养到有单菌落长出。

接种转化子于lb 试管中(zeo 20 μg ml-1，cm 5 μg ml-1)，37 c，170 r min-1过夜培养后分别提取基因组dna。

4. 研究创新点

特色或创新之处通过敲除突变体及相应的互补菌株iaa产量分析，推测ysen编码的iaa酰基转化酶可能参与sqr9中iaa合成的主要途径，ipya和tam途径也非常重要，通过基因组分析，转录水平分析，基因敲除和同源异源表达，可以得到sqr9中几个可能和iaa合成相关的基因，中间产物分析可确定这些基因在iaa的合成途径起的作用，以及对突变基因对iaa的合成影响的机理有更深层次的探索，通过实验分析iaa的产量变化对sqr9菌株促生效果的影响。

为更好地分析sqr9对植物促生的机制，对已知的sqr9的促生因子基因进行敲除病分析其对sqr9促生效果的硬性也十分重要，sqr9在不同环境下所使用的促生机制的变化也值得研究。

采用高效的液相色谱（hplc）按时间收集突变体Δysne和野生型sqr9发酵液组分，对发酵液中吲哚类物质进行分析也是本实验的一大特色。

5. 研究计划与进展

研究计划及预期进展2016年12月课题申请2017年1月拟定研究方法、技术路线、实验内容及准备实验材料2017年2月课题开题报告拟写及提交2017年2月开始实验2017年6月实验结束及论文答辩预期解淀粉芽孢杆菌SQR9双交换法基因敲除过程时间会和野生菌与原始菌株生理生长比较过程有差异，需要控制协调两个阶段之间可能出现的空窗期；而生理生长比较过程需要在较严苛的环境下连续培养，所以对实验影响因子的控制会影响到对生长曲线的测定。