1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
本课题的意义：
水稻是世界上最主要的粮食作物之一，水稻的产量高低直接决定着粮食安全。氮素营养一直是粮食生产过程中最主要的限制因素之一，影响着水稻生长发育的诸多方面。此外，水稻分蘖也是决定水稻产量高低的重要因素。水稻分蘖的多少受到多种因素的影响，其中氮素为最主要的因素之一。明确氮素和水稻分蘖之间的相互作用关系，对塑造完美株型、提高氮素利用效率以及提高水稻产量都具有重要的指导和现实意义。
国内外研究概况：
2. 研究的基本内容和问题
研究的目标：
本研究希望能够找到密切影响水稻产量的分蘖与氮素之间的联系，从而解决氮素在水稻体内如何转化为更加有效的营养，为提高水稻氮素利用效率、增加产量，提供分子育种技术基础。
内容：
3. 研究的方法与方案
研究方法：
1）水稻水培
种子去壳后，放入50mL离心管中加70乙醇、30NaClO溶液灭菌后，用去离子水将种子冲洗干净，移至于在铺有充分吸水的滤纸的平板上，暗培养催芽露白后，选取健壮的种子放在1/2MS培养基上培养，一周后选取长势一致的苗移栽到7L的转箱中培养。培养液采用pH 5.7的国际水稻所（IRRI）建议的修正营养液，分两组（2.5mM硝酸铵和0mM硝酸铵）。每2天换一次营养液。每个中转箱培养9株苗。培养条件为光照条件下温度30℃，黑暗条件下24℃，光照时长14h，黑暗10h，湿度为60。
2）RNA提取
用酒精将超净台台面、枪、离心管灭菌，取用水稻样品100 mg，快速研磨，转移到离心管中，加1ml Trizol (Invitrogen)，混匀，室温静置。4C 12000 rpm，离心10 min，加入0.2 mL氯仿，冰上静置15 min；4C 12000 rpm，离心15 min，将上清液转移到新的离心管中，并加入0.5 mL经-20C 预冷的异丙醇，混匀，在-20C 冰箱里静置20 min；4C 12000 rpm，离心15 min，弃上清。将离心管倒扣在吸水纸上吸干。加入1mL 75％的乙醇，用手指轻弹，4C 7500 rpm，反方向离心5 min；离心完毕，弃上清，3000 rpm，反方向离心。用移液枪将移除多余液体，吸出后室温风干。
3)定量PCR验证
①按下列组份配制PCR 反应液（冰上配制反应液）。
试剂使用量终浓度
试剂 | 使用量 | 终浓度 |
SYBR Premix Ex TaqTM（2） | 10.0 μL | 1 |
PCR Fward Primer（10 μM） | 0.4 μL | 0.2 μM |
PCR Reverse Primer（10μM） | 0.4 μL | 0.2 μM |
ROX Reference Dye | 0.4μL | |
DNA 模板 | 2.0 μL | |
dH2O（灭菌蒸馏水） | 6.8μL | |
Total | 20.0 μL |
②Real- Time PCR 反应条件
Stage1预变性 | Reps：1 | 95℃ | 30 | sec |
Stage2循环反应 | Reps：40 | 95℃ | 5 | sec |
60℃ | 30 | sec | ||
Stage3溶解曲线 | Reps：1 | 95℃ | 15 | sec |
60℃ | 60 | sec | ||
95℃ | 15 | sec |
③以管家基因(housekeeping gene) Ubqtin为内参，采用2-ΔΔCt方法对细胞分裂相关基因、独角金内酯相关基因进行定量分析
目标基因相对表达量2-ΔΔCt
ΔΔCt(Ct. Target-Ct. Ubqtin)TimeX-(Ct.Target-Ct.Ubqtin) Time0(Ct荧光阀值)并做图分析
技术路线：
分蘖芽的转录组分析验证 |
分蘖芽观察取样 |
RNA提取 |
候选基因表达量验证 |
实验方案：
实验材料：水稻品种：日本晴（O. Sativa L. , Nipponbare）
实验方法：
1）植物培养
种子去壳后，放入50mL离心管中加70乙醇、30NaClO溶液灭菌后，用去离子水将种子冲洗干净，移至于在铺有充分吸水的滤纸的平板上，暗培养催芽露白后，选取健壮的种子放在1/2MS培养基上培养，一周后选取长势一致的苗移栽到7L的转箱中培养。培养液采用pH 5.7的国际水稻所（IRRI）建议的修正营养液，分两组（2.5mM硝酸铵和0mM硝酸铵）。每2天换一次营养液。每个中转箱培养9株苗。培养条件为光照条件下温度30℃，黑暗条件下24℃，光照时长14h，黑暗10h，湿度为60。
2）分蘖芽生长情况的观察
对两组处理水稻进行连续观察，以叶子生长状况为标准。每当叶子抽出一半时，便开始取样观察分蘖芽生长变化。观察时，将水稻基部叶鞘去除，置于显微镜下观察拍照。第二分蘖芽，第三分蘖芽，第四分蘖芽分别用 2nd分蘖芽, 3rd分蘖芽，4th分蘖芽表示。拍完照后使用ImageJ free software 进行测量分蘖芽的长度。
3）RNA提取及定量PCR验证
4）转录组数据分析
根据博奥公司提供的数据进行分析。差异表达基因选择条件为change P-value0.05，logFC2 或logFC -2。更具NCBI、RAP-DB等生物信息网站对已有结果进行基因功能分析。
可行性分析：
基础设施基础：
申请人所在的植物营养分子生物学实验室具有的设施、设备包括：400 多平方米的实验室和组培室、人工气候植物生长室等。申请人所在实验室同时也隶属于南京农
业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室。
学生基础：
学生动手能力强，且对植物营养学分子生物学有着极大的兴趣和热情，愿意在科学研究上付出时间，有信心也有能力完成本次实验。
4. 研究创新点
水稻缺氮处理后的转录组分析已有报道，然而在特定时期及部位取样做分析的研究还没有，希望能够通过本研究揭示了氮素与水稻分蘖之间关系。
5. 研究计划与进展
研究计划：
2017月3月至4月，水稻培养，分蘖情况观察，采样。
2017年4月至5月，rna提取，检测，反转录及定量pcr。
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