噬菌体组合抑制番茄青枯病的效果研究开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

番茄青枯病是由土传青枯菌ralstonia solanacearum（rs）引起的一种细菌性维管束病害。青枯菌通过根尖伸长区细胞或者次生根生长点的伤口处进入西红柿的根部。青枯菌一旦进入植物的根部，继而通过植物的维管束，从根部向地上部分迁移。青枯菌能产生一些致病性因子，如Ⅲ-型效应子、胞外多聚糖（eps)和降解植物细胞壁的酶类物质如纤维素酶和果胶裂解酶。随着青枯菌在植物木质部的大量生长繁殖，胞外多糖的含量剧加，从而阻止了水分从植物根部向茎部的运输，最终导致植物的枯萎甚至使植物死亡。由于其病原菌在环境中适应突变能力强，一直都缺乏有效的防治手段，化学防治虽然有一定效果，但随着青枯菌抗药性、耐药性的提高，大田防效越来越差，而且化学药剂的使用会对大田的的环境造成破坏，改变土壤微生物群落的种群多样性，且农药残留对人类健康也带来很大的危害。且一直以来，国内的生物防治资源大部分局限在细菌、真菌、放线菌上，目前对噬菌体的研究还是比较单一，一直停留在单一噬菌体防控青枯病的研究，但青枯菌能够快速进化对抗单一的噬菌体，使其活性大大丧失。若能筛选多株专性噬菌体进行组合来抵抗植物青枯病必将会成为一种良好的生物防控剂。

20世纪90年代日本学者分离到噬菌体p4282 和pk101，用于控制青枯病。tanaka 等用含噬菌体的无毒青枯菌株 m4s 对烟草进行预处理，可有效降低青枯病的发病程度;用噬菌体和 m4s 菌株共同进行处理则效果更佳。但这些噬菌体的寄主范围狭窄，只能侵染一部分青枯菌。而具有实际应用价值的噬菌体必须有宽的寄主范围和强的溶菌能力。kawasaki 等分离获得短尾噬菌体科(podoviridae) 噬菌体 Ｒsb1，Ｒsb1 寄主范围最广，能侵染15 个供试青枯菌中的 14 个。Ｒsb1 还能溶解寄主细胞，并形成 10 ～ 15 mm 的溶解圈。yamada 等分离到几株噬菌体，能侵染不同生理和生化小种的青枯菌。肌尾噬菌体科 ( myoviridae) 噬菌体Ｒsa1寄主范围非常广泛，测试的 15 株青枯菌分别属于生理小种1、3、4 和生化小种 1、2、3、4，均对该噬菌体敏感。噬菌体 Ｒsl1 是另一个肌尾病毒，包含 231 kb 基因片段，该噬菌体能溶解 15 个供试青枯菌中的 10个。fujiwara 等发现接种溶菌性噬菌体 Ｒsl1 的摇瓶中青枯菌细胞密度仅为不接种的 1 /3;番茄苗经噬菌体 Ｒsl1 处理后显著降低了青枯菌的侵染;在考察期间Ｒsl1 处理植株没有表现出发病症状，而对照在接种青枯菌 18 d 后全部发病。

参考文献

2. 研究的基本内容和问题

项目研究目标、内容和拟解决的关键问题

研究目标

1、探明四株噬菌体组合与其抵抗青枯菌入侵的关系

3. 研究的方法与方案

研究内容

1、研究四株噬菌体组合与其抵抗青枯菌入侵力的关系（微孔板系统）

2、噬菌体组合应用效果研究（育苗盘系统）

研究方法

（1）病原菌与噬菌体组合共培养实验（微孔板系统）

该系统主要用于研究噬菌体组合抵抗青枯菌入侵，由以下 4 个环节组成（如下图）。①培养基：该系统所用培养基是 NA培养基；②接种微生物：即接种噬菌体或病原菌（红色荧光标记菌株）悬液， 噬菌体与病原菌共培养，病原菌在NA试管液体培养基中30℃，170 rpm培养12h ，菌液5000r/min离心5min，用生理盐水分别调OD600到0.5。噬菌体的准备：向OD600的病原菌悬液中加入单个噬菌斑，30℃，170 rpm培养12h，菌液12000G离心5min，过滤除菌，得到的噬菌体悬液4℃保存备用。在96孔板中加入200 l NA培养基,再在每孔中分别加入4l 病原菌菌液，按设置的不同组合水平添加噬菌体悬液，组合中的噬菌体的添加量保持一致，总量为107 pfu/mL，30℃ 170 rpm培养72h，每隔数小时测OD600。③振荡培养：控温摇床，除特殊说明外，培养温度为 25℃，转速为 170 r/min，培养时间根据实验需求设定；④酶标仪检测：即在培养不同时期用酶标仪检测群落的 OD600 、红色荧光强度（发射光：587 nm，吸收光：610nm）

（2）噬菌体混合体系的应用效果研究(盆栽-田间系统)

该系统主要是验证噬菌体组合在生产应用中对于青枯病的防治效果。本实验以Micro Tom番茄种子为研究对象，在宜兴科研基地温室大棚中进行实验。取新鲜番茄种子进行表面消毒，在营养琼脂平板上进行无菌催芽，放入培养箱中培养48h，将萌发的种子移入育苗盘中育苗，待番茄幼苗长至2-3片真叶时进行移栽，移栽一周后接种病原菌Rs1115。设置实验组和对照组，待病原菌侵入番茄根部约一周后，将实验组接种噬菌体和噬菌体组合，观察番茄植株发病情况并记录。

技术路线

可行性分析

(1) 学科基础强。实验室提供了坚实的实验背景和技术硬件条件。

(2) 研究思路清晰。在文献查阅、前期研究结果和理论分析的基础上提出研究假设，并利用微孔板系统及育苗盘-田间系统，从室内研究到田间实验逐级开展工作，本项目所采用的技术和方法本实验室已掌握。方案设计合理，必能清楚地揭示这一科学问题。

(3) 研究基础扎实，团队合作性很强。

4. 研究创新点

微生物的一种环境胁迫适应能力的增加往往以另一种胁迫适应能力下降为代价的。这种trade-off【指在生物的生命历程中，由于可供分配的资源有限，特定两个特征间相互作用，即提高一种特征的优势的时候，另一种特征的优势将降低。】关系非常普遍。本项目的创新点正是将这一进化生态学理论应用在土传青枯病的防控中，针对RS的易突变特性，拟通过多种高效RS特异性噬菌体组合形成双重胁迫阻控RS有利突变（增加其生存和致病能力），以达到降低病害发生的目标

5. 研究计划与进展

研究计划及预期进展

2016年10月至2016年11月 噬菌体组合的微孔板抵御青枯菌入侵能力；

2016年12月至2017年1月 噬菌体组合防控青枯菌应用效果研究；