不同温度对贵州木霉NJAU4742分解木质纤维素的影响及其机制研究开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

1、课题意义及应用前景当前世界能源、资源以及环境问题日趋严重，人类通过长期的研究并希望通过纤维素酶将地球上最丰富、最廉价的植物纤维转化为能被人类利用的能源和资源，随着纤维素酶需求量的增加，高效的纤维素分解菌的获得已经成为世界各国微生物界研究的热点，特别是在堆肥以及生物能源领域的研究。

2、国内外研究进展大量的研究表明，接种菌剂可以使堆肥物料快速达到高温，缩短堆肥腐熟进程，有效杀灭病原微生物，提高堆肥质量，施用后作物增产效果显著。

而在堆肥过程中形成的中间产物大多为碳水化合物，这些糖类化合物将会阻遏堆肥体系中纤维素分解类微生物纤维素酶和半纤维素酶的分泌，特别是在代谢的旺盛期尤为明显，这势必会影响堆肥的效率。

2. 研究的基本内容和问题

1、研究目标 （1）寻找对菌株t. guizhouense njau 4742在三种温度下分解木质纤维素的差异：（2）揭示不同温度对菌株t. guizhouense njau 4742木质纤维素酶系调控及其机制。

2、研究内容 （1）在20℃、28℃和37℃三个温度下进行固体发酵，提取固体发酵样品及其浸提液；（2）对提取的样品进行胞外蛋白含量和酶活测定，提取胞内蛋白并测定胞内蛋白含量；（3）利用swath技术测定不同温度条件下菌株trichoderma. guizhouense njau 4742总蛋白表达情况，并绘制出t. guizhouense njau 4742在不同温度条件下的代谢通路。

（4）根据swath技术分析的结果，进行从蛋白到基因表达的验证。

3. 研究的方法与方案

1、研究方法通过不同温度下t. guizhouense njau 4742与水稻秸秆固体发酵的研究，发现三种温度下t. guizhouense njau 4742分解木质纤维素能力具有显著差异。

2、技术路线详见附件3、实验方案（1）实验处理：处理一：140ml mandels培养基 60g稻草粉，放置于20℃培养七天处理二：140ml mandels培养基 60g稻草粉，放置于28℃培养七天处理三：140ml mandels培养基 60g稻草粉，放置于37℃培养七天调节ph为6.0左右，并将之拌匀，高温灭菌后进行接菌，每个处理设置三个重复。

（2）取培养第一天至第七天的发酵后产物，取5g产物于锥形瓶中，加入50ml无菌水放入28℃摇床中摇1h后，取出液体用于测定酶活和胞外蛋白； （3）收集锥形瓶中上清后，继续加入1m naoh溶液，28℃摇1h后，取出液体用于测定菌丝蛋白含量； （4）固体发酵容器中剩余的发酵产物保存于-80℃冰箱用于提取胞内蛋白和rna；（5）固体发酵容器中剩余的发酵产物用于13c核磁共振的检测；（6）固体发酵容器中剩余的发酵产物用于电镜的检测；（7）取培养第一天至第七天的固体发酵容器中气体进行co2 的检测。

4. 研究创新点

本实验选取了3个温度，分别为20℃，28℃和37℃，在三种不同的温度下分别研究真菌对水稻秸秆的分解情况。

在此项研究中，木霉分泌的蛋白质被使用等压标签进行相对和绝对分析通过纳米lc-ms / ms定量（swath）。

被检测到的蛋白质在不同通路上的富集差异说明了在不同温度下蛋白质的响应情况，并且通过对检测到的所有的差异蛋白的interaction分析结果，表明了在不同温度下起最关键作用的蛋白质。

5. 研究计划与进展

1、研究计划通过预实验选择出了T. guizhouense NJAU 4742对产酶影响梯度最大的3个温度，并开始进行固体发酵实验（1）2018.01-2018.03：完成固体发酵实验，通过测定酶活、胞外蛋白含量以及电子显微镜、核磁检测；（2）2018.03-2018.04结合蛋白组和转录组的数据，分析不同处理条件下菌株T. guizhouense NJAU 4742木质纤维素分解的代谢通路；（3）2018.05-2018.06 基因的后续验证。

2、预期进展通过固体发酵实验找出对菌株T. guizhouense NJAU 4742在三种温度下分解木质纤维素的差异，提取发酵液、RNA等，分析蛋白组的数据，并进行后续基因的验证。