黄酮类甲基转移酶的研究开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

黄酮类化合物泛指两个具有酚羟基的苯环通过中央三碳原子连接的一系列化合物，黄酮类化合物通常具有c6-c3-c6的核心结构。

根据中央三碳的氧化程度、是否成环（c环）、b环的联接位点等特点，可将该类化合物分为多种结构类型，包括黄酮类、黄酮醇类、二氢黄酮类、二氢黄酮醇类、二氢异黄酮类、查尔酮类、橙酮类、黄烷类、花色素类和双黄酮类以及他们的一系列衍生物。

黄酮类化合物在植物体中通常与糖结合成苷类，基本骨架上通常有羟基、甲氧基、甲基、异戊稀基等取代基，这些修饰的存在极大的丰富了黄酮类化合物的种类。

2. 研究的基本内容和问题

研究目标1、鉴定拟南芥 ccoamt7 基因的生物学功能；2、筛选与 ccoamt7 相互作用的 sam 合成途径酶；3、分析 sam合成途径酶的蛋白互作对于黄酮类甲基反应的影响。

研究内容1、拟南芥 ccoamt7基因的生物学功能1.1、获得 ccoamt7 的 t-dna插入突变体；1.2、获得 ccoamt7 的过量表达转基因植物；1.3、鉴定上述植物黄酮类化合物的组成。

2、 ccoamt7 与 与 sam合成途径酶的蛋白互作2.1、利用酵母双杂交检测体外结合；2.2、利用免疫共沉淀检测体内结合；2.3、利用 split luciferase 系统检测 sam、sah、hcy、甲硫氨酸和 atp 对于上述反应的影响。

3. 研究的方法与方案

研究方法1、ccoamt7 与 sam合成途径酶的蛋白互作将 ccoamt7 与 sam 合成途径酶的所有基因编码区克隆到pzeo（invitrogen） 载体；将上述基因同源重组整合到由 pgbkt7 和 pgadt7rec 改造的酵母双杂交gateway载体 plaw10 与plaw11，把所得载体分别转入酵母株系 ah109 gold 和 y187 中。

通过酵母杂交将 ccoamt7 与 sam 合成途径酶一一组合，随后观察在营养缺陷培养基上的生长状况。

将在缺腺嘌呤和组氨酸培养基上生长的阳性组合对应基因分别重组到连有ha和 cmyc 肽段的转基因载体中，利用农杆菌注射共同瞬时转化烟草，提取总蛋白后利用结合ha的树脂沉淀，再沉淀产物中用 cmyc 的抗体检测另一相互作用蛋白，研究它们的体内结合。

4. 研究创新点

本项目的特色与创新之处1、sam 合成整个循环酶与 ccoamt7蛋白互作筛选虽然 sam在植物中参与多达 381个反应，但是拟南芥的 sam合成循环比较简单，更具同源预测得到酶仅有 9 个。

所以作出 ccoamt7 蛋白可能与 sam 合成循环酶相互作用的预测后，本课题组拟将所有的 sam 合成循环酶全部克隆，将它们与 ccoamt7一一组合，利用酵母研究蛋白结合的可能。

本课题组的研究策略基本覆盖了所有的组合，避免假阴性，所以得出的实验结论非常准确。

5. 研究计划与进展

研究计划1、蛋白质纯化：3月1日到15日。

2、体外结合（3月19日到30日）：ccomt7sahh1；ccomt7sams3；ccomt7sahh1sams3；sahh1sams33、体外flux实验（4月1日到13日）：ccomt7 sam，ccomt7 sam sahh，ccomt7 methione，ccomt7 methione sams, ccomt7 methione sams sahh，uplc 检测，q与i标准品对比。

4、烟草瞬时表达（4月15日到5月15日）组合：ccomt7 sahh1 sams3， ccomt7 amisahh sams3， ccomt7 pdmc43，底物：l-methionine-(methyl-13cl-甲硫氨酸：sigma 299146-1g) quercetin 槲皮素产物：isorhamnetin-c13。