PMO-5-原核蛋白表达开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

本课题的意义：高效、环保地降解抗拒性的多糖物质包括纤维素和几丁质是目前开发和利用生物质能源的一大瓶颈。

近年来，溶解性多糖单加氧酶（lpmo）的发现对于解决这一难题指明了一条新的方向。

lpmo 通过氧化裂解结晶多糖底物，破坏了结晶底物的结构从而使糖苷水解酶更易和底物结合，最终协同提高了多糖的水解效率。

2. 研究的基本内容和问题

研究目标：为发掘更多的新酶资源，本课题对pmo-5目的基因展开研究工作。

我们希望通过表达和表征这个蛋白，研究这该蛋白的复变性并进行 ni 柱亲和纯化，为今后进一步研究与应用 lpmo 提供重要参考。

研究内容： 本课题以 aa11 家族的溶解性多糖单加氧酶基因为研究对象，主要进行了以下的研究内容：（1） lpmo 基因（pmo-5）的分子克隆和重组质粒的构建；（2） lpmo 基因在大肠杆菌 arcticexpress 中的表达； （3） lpmo 蛋白的复变性和 ni 柱亲和纯化；（4） lpmo 蛋白的性质研究拟解决的关键问题：通过pmo-5目的基因的异源性表达，测定该蛋白的性状，为研究 a.fumigatus z5多糖单加氧酶的特性提供重要参考依据。

3. 研究的方法与方案

技术路线:1. plte-4481 质粒构建2. 基因测序3. 质粒酶切鉴定4. 载体构建图谱5. 翻译后蛋白序列6. plte-4481 载体转化至大肠杆菌 arctic express7. iptg 诱导载体融合蛋白的表达8. pmo-5-his 包涵体蛋白的变复性9. 融合蛋白的 ni 柱亲和纯化10. 蛋白表达纯化11. western blot 检测实验方案：以客户提供的 pet-29a-pmo-5 质粒为模板，设计特异性的引物，扩增目的基因序列，将获得的目的基因 pmo-5 克隆到载体 plte 的 nde i 和 xba i 位点之间，获得的重组质粒plte-pmo-5 分别转入 top10 克隆菌株和 arcticexpress 表达菌株。

使用 iptg 诱导表达目的蛋白 pmo-5。

优化表达条件，将诱导条件调整至 37 度，经分析目标蛋白主要呈包涵体形式，上清中无表达亦或表达量低，因此通过变复性的方式，重溶目标蛋白 pmo-5，通过 ni 柱亲和纯化获得目的蛋白。

4. 研究创新点

以大肠杆菌 Arcticexpress 为载体，使用 IPTG 诱导表达目的蛋白 pmo-5，以复变性的方式重溶目标蛋白，通过纯化后用 Western Blot 验证有无目标蛋白的表达。

5. 研究计划与进展

1.2018：三月中：完成开题报告2.2018：四月初: 完成中期报告3.2018：五月初：毕业论文草稿4.2018：五月中：毕业论文定稿