水稻铁转运蛋白OsFPN1的基因敲除材料构建及蛋白亚细胞定位研究开题报告

全文总字数：8624字

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

铁是水稻生长和发育所必需的营养元素之一，在植物体内，铁存在于光合作用和呼吸作用的电子传递链中，参与了无机氮转化为有机氮的固氮作用和引号传递等生理生化活动，铁对植物产量和耐逆性有重要影响。此外，铁也是人和动物易于缺乏的必需微量元素，因此，解析植物铁的吸收、转运和利用分子机制一直是植物营养学研究的热点。然而，植物对铁的吸收、转运和利用是一个复杂的过程，很多基因都参与了这一过程。近年来，人们在铁元素营养分子生物学方面的研究取得了很大的进展。

经研究，人们已经对高等植物中铁的吸收机制有了一定的认识。由于生长环境的差异，植物形成了不同的高效铁吸收机制，以保证获取充足的养分。根据吸收利用铁元素方式的不同，植物被分为机制Ⅰ植物和机制Ⅱ植物^[1]。机制Ⅰ植物主要包括双子叶植物和禾本科以外的单子叶植物，该机制由h -atpase泵系统、fe³ 还原系统和fe² 的转运系统组成。植物通过h -atpase泵向土壤中分泌h ，降低土壤ph以提高铁的溶解性。之后fe³ 被还原酶和与之偶联的nadph脱氢酶转化为fe² ，再通过根系细胞质膜上的转运蛋白进入根系而被吸收；机制Ⅱ植物主要指禾本科植物，在受到低铁胁迫时，植物释放大量的铁载体(phytosiderophores, ps)与根际中的fe³ 直接结合，以螯合物的形式转运至细胞，再释放出fe³ 以供植物利用^[2]。

至于植物中铁在地上部的再分配机制，人们依然处于探索阶段。1996年，eide^[3]等通过筛选拟南芥根部cdna文库，找到了fe² 转运蛋白atirt1(iron-regulated transporter 1)和atirt2。atirt1不仅能转运铁，还能转运锰、锌和铬。atirt1与酵母的锌转运蛋白zrt1 (zinc regulated transporter 1)是同源基因，且irt1在植物、线虫和人类中也有同源序列，因此被称为zip(zrt/irt-related protein)家族。atirt2与atirt1有着相似性，它可能是一个低亲和力铁转运蛋白，在铁充足的情况下发挥作用，或在其它金属离子的吸收中起着比铁转运更重要的作用^[4]。另一类金属转运蛋白是nramp(natural resistance-associated macrophage protein)家族。gunshin^[5]等人和curie^[6]等人将此家族分为两类。拟南芥中的atnramp1、3和4与水稻osnramp1和osnramp3等代表一类，是具有多种底物特异性的蛋白。过量表达 atnramp1 基因的植株表现出更强的高铁毒害耐受性，而过量表达atnramp3基因的植株在镉处理时积累更多的铁；拟南芥的atnramp2- 5和水稻 osnramp2 则代表了另一类nramp蛋白，关于此类蛋白功能的研究仍在继续进行中。另外，ysl（yellow stripe-like）也是一类在铁转运和分配中起作用的转运蛋白。水稻已有18个ysls基因被克隆和鉴定，ysls在根和茎叶中均有表达。osysl2，-15和-18与铁在植株中的分配有关，它们能转运fe3 -na^[7]。在双子叶植物中，ysl也起转运铁和尼克酰胺复合物的作用^[8]。

2. 研究的基本内容和问题

1. 研究目标

1）构建靶序列为osfpn1的crispr/cas9的双元表达载体，为后续获得osfpn1功能缺失型材料奠定基础。

2）克隆出基因，融合gfp标签，构建双元表达载体，在烟草中瞬时表达，探究osfpn1蛋白亚细胞定位，为解析基因功能奠定基础。

3. 研究的方法与方案

1. 研究方法

   1）CRISPR/Cas9载体构建：

   靶点引物设计——菌种活化和质粒提取制备及其质量检测——sgRNA表达盒的构建——酶切-连接反应——连接产物转化——阳性克隆检测——pYLCRISPR/Cas9载体导入农杆菌

   2）OsFPN1蛋白的亚细胞定位分析：

   水稻cDNA的制备——亚细胞定位瞬时表达载体的构建——烟草叶片瞬时表达

2. 实验方案

   2.1CRISPR/Cas9载体构建

   2.1.1靶点引物设计

   根据引物设计原则和水稻各品质性状候选基因序列，靶点的GC%不宜低于40%，以提高打靶效率。对靶点序列进行特异性分析，用靶点序列＋ＮＧＧ与水稻基因组特异性分析，尽量避免靶点序列与水稻基因组其它位点比对差异多于５个碱基。

   2.1.2 菌种活化和质粒提取制备及其质量检测

   将选好的pYLCRISPR/Cas9质粒菌种和pYLgRNA-U3/U6质粒菌种分别在含有卡那霉素(25g/mL)和氨苄青霉素(100 g/mL) LB平板培养基划线培养过夜，挑取单菌落用LB液体培养，并用质粒提取试剂盒提取质粒。用2-3U BsaⅠ试切约150ng质粒，电泳检查。

   2.1.3 sgRNA表达盒的构建

   我们将利用overlapping PCR法构建sgRNA表达盒。

1. 第一轮PCR

   此步骤的目的是分别将靶点序列引入到U3/U6启动子下游和sgRNA序列的上游。

   扩增25~26个PCR循环: 95℃ 10 s，58℃ 15 s，72℃ 15 s。

   取3-5 L PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检查。

   表1 表达盒构建的第一轮PCR反应体系

1. 第二轮PCR

   此步骤目的是将启动子、靶点和sgRNA构建成完整的表达盒。

   取第一轮PCR产物1l用H₂O稀释10倍，各取1l混合为模板。各表达盒20-50lPCR。加入1/10量每种引物组合工作液。使用适量KOD-Plus或其它高保真PCR酶。

   扩增17-20循环：95℃ 10s，58℃ 15s，68℃ 20s。

   取2-3 L PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检查。

   2.1.4 酶切-连接反应

   表2 酶切-连接反应体系

扩增10-15个循环：37℃ 5min，10℃ 5min，20℃ 5min，37℃ 5min。

2.1.5 连接产物转化

将定量的连接产物滴载在悬浮式透析膜，它的孔径是0.025pm，在４℃冷柜内用0.2×TE稀释脱盐透析20min；取1l连接产物与20l大肠杆菌感受态细胞混合，吸取至预冷的电激杯，以1.8kv/20l感受态细胞电激转化，将菌体转入1ml SOC培养基中37℃摇晃培养1h。在LB培养基板涂板含有25吨/mlKan，0.5mM IPTG和适量X-gal。培养过夜，LacZs表达产生蓝色菌斑为阳性克隆。

2.1.6 阳性克隆检测

挑取数个蓝色(如果使用了LacZ)菌落培养和提取质粒，并用MluⅠ或AscⅠ酶切和电泳确认。也可以用菌落PCR进行筛选，用灭菌牙签挑取菌落的少量菌作为模板，对一个或所有靶点进行PCR检测。引物配对形式为：SP-R引物与第一表达盒启动子反向引物配对；第一靶点接头正链引物与第二靶点负链引物配对；第二靶点正链引物与第三靶点负链引物配对；第三靶点正链引物与第四靶点负链引物配对；如此类推。选1个阳性克隆进行测序。

2.1.7 pYLCRISPR/Cas9载体导入农杆菌

将获得的阳性克隆提取质粒，并电激转化农杆菌（如EHA105）。 如果要做质粒在农杆菌的稳定性检测，从农杆菌提取质粒（农杆菌提取质粒质量较差，只适合做PCR），取约2-5 ng质粒为模板，用所有靶点接头正向引物和反向引物配对进行PCR，然后电泳检测确认。如果表达盒结构未发生变化，获得的农杆菌可用于植物转化。

2.2 OsFPN1蛋白的亚细胞定位分析

2.2.1 水稻cDNA的制备

提取出水稻总RNA，将总RNA反转录为cDNA。反应体系如表3所示，30℃ 10 min，

42℃ 20 min，99℃ 5 min，4℃ 5 min。

表3 反转录反应体系

2.2.2 亚细胞定位瞬时表达载体的构建

根据水稻OsFPN1基因在NCBI数据库中序列设计引物，以水稻的cDNA为模板，扩增带有酶切位点的OsFPN1的ORF全长（去除终止子）。采用10l体系进行PCR反应：94℃ 5 min，94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 2 min，重复34个循环；72℃ 10 min。扩增完成后进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。目的基因片段进行切胶回收并纯化。将纯化的目的基因片段连接到pMD18-T克隆载体上，转化农杆菌感受态细胞，PCR筛选阳性克隆，提取质粒后进行测序分析。

表4 PCR反应体系

2.2.3 烟草叶片瞬时表达

采用注射器直接将农杆菌注射至叶片下表皮细胞间隙方法的技术流程是: 烟草植株21℃土培5-6周，光周期为14 h /d。挑取农杆菌单菌落于4 mL LB培养基中，30℃200 r/min 过夜培养。吸取1-1.5 mL菌液置于50 mL YEB培养基中，28℃继续培养8 h。室温下2200 g 离心10 min。弃上清，用 50 mL 渗透液( 250 mg D－葡萄糖、5 mL 50 mmol /L MES、5 mL 2 mmol /L Na3PO4·2H2O、5L 1 mol /L乙酰丁香酮) 重悬至D600 nm为 1.0，室温放置至少 3 h。用无菌1 mL 医用注射器吸取菌液，将针头刺入下表皮，轻轻将菌液注射进下表皮空隙中。烟草注射菌液后继续在 22-24℃ 下培养，36 h后进行荧光检测。

2.3 水培试验

用中花11野生型水稻种子进行水培实验，在营养元素充足和生长环境一致的情况下，在温室内培养4周。从第5周开始，对其设置不同的亚铁离子浓度处理：0mM、0.0001mM、0.001mM、0.01mM和10mM。 并在0h、3h、6h、12h、24h、48h和72h对植株的地下部和地上部分别采用RT-PCR测定目的基因的mRNA含量，以分析目的基因在不同亚铁离子浓度处理下，在植株不同部位的表达模式。

3、可行性分析

1）拟南芥中的铁转运蛋白AtFPN1已有研究成果，为本实验的进行提供了

理论依据和技术指导。

2）实验室具备所有分析实验所需要的试剂、仪器和设备。

3）实验室人员均可独立而熟练地进行分子实验，具备基础实验技能。

4. 研究创新点

目前对于水稻OsFPN1蛋白的研究成果很少，本实验通过对其进行基因敲除材料构建和亚细胞定位，以探究该基因的功能，填补了该基因研究的空白。

5. 研究计划与进展

2019.2底——2019.3初 了解课题要求，查找资料及撰写开题报告

2019.3——2019.4 crispr载体构建；亚细胞定位瞬时表达载体的构建；水培试验测定材料准备

2019.4——2019.5 crispr载体构建；osfpn1蛋白亚细胞定位分析；定期测定水培试验的蛋白表达程度