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1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
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课题的意义
谷胱甘肽是机体内重要的生物活性物质，在许多重要的生物学过程中起着直接或间接的作用，如物质的运输、蛋白质和dna的合成、酶的活性、新陈代谢及细胞的保护等[1]。谷胱甘肽是许多酶反应的辅基，可作为抗氧化剂保护生物分子蛋白的巯基，清除体内过多的自由基，具有较强抗氧化作用[2]。谷胱甘肽还是蓝藻和变形杆菌以及所有线粒体或携带叶绿体的真核生物中含量最丰富的硫醇之一[3]。在细菌中，谷胱甘肽除了在维持蛋白质硫醇的适当氧化状态中发挥关键作用外，还在保护细胞免受低ph、氯化合物以及氧化和渗透应力的作用中起着关键作用。γ-谷氨酰半胱氨酸是以半胱氨酸和谷氨酸为底物由γ-谷酰胺半胱氨酸合成酶作用合成的。它是合成谷胱甘肽的重要步骤之一，γ-谷氨酰半胱氨酸和甘氨酸在谷胱甘肽合成酶的作用下合成谷胱甘肽。而谷胱甘肽的形成反过来会抑制γ-谷氨酰半胱氨酸的合成。所以γ-gc与gsh密切相关，因此建立一种同时测定gsh和γ-gc的测定方法对研究谷胱甘肽有重要意义。
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研究的目标
希望能开发一种可同时鉴定细菌胞内谷胱甘肽和γ-谷氨酰半胱氨酸高效液相色谱分析方法。
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研究方法
1.1阅读文献法：根据研究课题调查与测定巯基化合物有关的文献，包含研究现状、研究方法等，依据收集到的资料对巯基化合物的分离与测定有较为详细的认知，并且制定较为详细、可靠、可行的实验方案来获得巯基化合物分离的优化方法。
1.2实验法：通过控制条件、减少或消除各种可能影响科学的无关因素的干扰，通过对实验物质的分析，对液相分离条件进行微调，从而得出最佳的液相分离巯基化合物的方法。
菌株样品的制备
2、技术路线
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实验方案
实验仪器：使用分光光度计（UV-1800）检测菌株的长势。使用Infinity 1290 UPLC系统或1260 Infinity HPLC系统（美国安捷伦公司）结合荧光检测器分离硫醇衍生物。液相分离柱为Symmetry C8 Column（公司名；100, 5 m, 3.9 mm X 150 mm）。
试剂：三氟乙酸（99）、一溴双环烷（95）、三（2-羧基乙基）膦盐酸盐（98）、甲磺酸（99.5）、4-（2-羟乙基）-哌嗪-1-丙烷磺酸（99）和谷胱甘肽（98）。二乙烯三胺五乙酸（99）是从麦金林（中国上海）获得的。高效液相色谱法乙腈是从默克公司（德国达姆施塔特）获得的。整个研究中使用的水为18.2 M Ω cm的超纯水。
实验步骤：
1. 菌株样品的制备
将LB培养基中的阴沟肠杆菌CZ-1接种到100 ml的ST10-1培养液中，培养24 h后分两管离心，将其中一个离心管的菌体烘干称干重，另一个离心管的菌体用于巯基化合物的提取。
2. 摸索胞内巯基化合物的提取方式
测定比较以下这三种提取方式提取的GSH和γ-GC含量，选择最佳提取方式。
2.1 收集不少于106 个细胞，首先用PBS清洗细胞2次（PBS重悬细胞，600g离心10分钟），加入600μl 已优化至最佳的萃取介质重悬细胞，反复冻融2~3次（可在液氮中冻结，37℃水浴中溶解），8000g离心10分钟，收集上清于4℃待测。
2.2收集不少于106 个细胞，首先用PBS清洗细胞2次（PBS重悬细胞，600g离心10分钟），加入已优化至最佳的萃取介质，用超声破碎10分钟，8000g离心10分钟，收集上清于4℃待测。
2.3收集不少于106 个细胞，首先用PBS清洗细胞2次（PBS重悬细胞，600g离心10分钟），加入已优化至最佳的萃取介质，用超声波破碎仪破碎1分钟，8000g离心10分钟，收集上清于4℃待测。
3. 优化巯基化合物的衍生化效率
3.1、三（2-羧基乙基）膦盐酸盐和一溴双烷浓度：
通过测定GSH和γ-GC等硫醇标准品的荧光光谱峰面积，研究了最终三（2-羧基乙基）盐酸膦浓度（0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.75和1 mM）对荧光强度的影响。最终浓度确定为加入甲磺酸终止衍生反应后萃取介质中盐酸三（2-羧基乙基）膦的浓度。为了确定观察到的荧光强度降低是否是由于三（2-羧基乙基）膦盐酸盐与单溴联苯烷的反应引起的，反应介质中含有不同的三（2-羧基乙基）膦盐酸盐浓度（0，0.05，0.1，0.2和0.4 mM）或单溴联苯烷浓度（0.1，0.25，0.5，制备0.75和1 mM），加入或不加入10 mg /1谷胱甘肽，并用高效液相色谱法进行分析。
3.2、萃取介质的酸碱度：为了确定溶液pH是否影响混合硫醇标准品的荧光强度，用NaOH或HCl将含有最佳浓度三（2-羧基乙基）膦盐酸盐的萃取介质的pH调整为5.0、6.0、6.5、7.0、7.25、7.5、7.75、8.0或8.25。
3.3、反应温度：
为了确定温度是否影响巯基化合物的衍生化效率，将反应温度调整为15、25、30、37、45和60℃，反应时间为30分钟。
4. 优化同时测定GSH和γ-GC的液相分离条件
经查阅文献，选择了两种不同的液相分离条件。
4.1采用液相色谱HPLC-FL，色谱柱为C-18柱，柱温保持40℃，激发光波长380nm ,发射光波长470 nm。
流动相A：0.15三氟乙酸(TFA) 5乙腈(ACN)的水溶液
流动相B： 0.1三氟乙酸(TFA)的乙腈(ACN)溶液
4.2液相分离柱采用Symmetry C8 Column
流动相A：1甲醇、0.25乙酸、10 mM 四丁基高氯酸胺(TBAP) pH为3.4
流动相B：90甲醇、0.25乙酸、10 mM四丁基高氯酸胺(TBAP)
洗脱流程根据具体结果进行调整，最后通过实验结果确定最佳液相分离条件。
5. 利用高效液相色谱测定菌株体内GSH和γ-GC的含量
利用优化后的巯基化合物衍生方法和最佳的细胞内巯基化合物提取方式，将菌株内的巯基化合物提取出来，然后利用优化后的试剂柱子和洗脱流程，用高效液相色谱仪检测菌株体内GSH和γ-GC的含量。
可行性分析
4.1实验室在巯基化合物检测上已有一定的研究积累；
4.2经费充足且仪器设备可满足本实验的需求。
4. 研究创新点
特色或创新之处
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研究计划及预期进展
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