不同程度重金属污染对稻田土壤微生物群落结构的影响开题报告

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1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

随着人类社会的发展,土壤污染己经成为全球化的环境问题,土壤重金属污染是其中最严重的生态问题之一。重金属作为一类重要的土壤污染物,在土壤中不为微生物所分解,当超过一定限度时便对植物和土壤微生物产生不可逆毒害作用。例如，我国农田土壤重金属镉污染形势严峻，研究报道，目前我国已有超过13万km²的耕地被cd污染，包括11个省市，25个地区，污染范围广、规模大，对生态系统安全构成巨大的威胁。据近期调查显示，土壤cd污染物含量呈现从西北到东南，从东北到西南逐渐升高的地理分布势态，且西南地区重金属超标范围较广。显然，重金属cd污染使南方红壤生态系统已具风险性。稻田是我国重要的农业生态系统。近年来,随着采矿、冶金业的迅速发展,污水灌溉以及农药、化肥的大量使用,我国稻田土壤重金属污染已日趋严重。

土壤微生物是维持土壤生物活性的重要组分，在地球生物化学循环过程中扮演重要角色，几乎参与土壤中一切生物和生物化学反应，包括对动植物残体的分解、养分的贮藏转化、水分入渗、气体交换、土壤结构的形成与稳定、有机物的合成及异源生物的降解等方面，与土壤中的动植物相比土壤微生物群落结构组成对外界环境污染干扰更加灵敏。因此，土壤微生物群落结构是表征土壤生态系统群落结构和稳定性的重要参数，能够较好地指示土壤环境污染状况。随着现代生物技术的发展和分子生物技术水平的提高，在分子水平上研究重金属污染对土壤群落结构的影响已经成为可能。

中国稻田土壤的固碳水平、潜力已有较丰富的认识和资料积累,在团聚体尺度上也开展了较多的固碳机理的研究,包括物理保护、化学结合、生物学的稳定等。固碳与农田生态系统生产力和生态服务功能的耦合机制是当前稻田土壤固碳研究的中心内容。但土壤有机碳微生物的稳定性研究在以往土壤固碳理论的系统研究中较少。近年来，有研究者已经开始探索在有机质稳定的化学过程基础进一步探索稻田土壤固碳的微生物稳定机理，比如对不同地区的长期试验不同处理的水稻土的微生物区系、土壤呼吸及代谢商等进行研究。重金属污染作为影响土壤微生物区系的环境胁迫因子是如何影响这一过程或机制的目前也鲜见报道。

2. 研究的基本内容和问题

本研究的目标是探究不同程度的重金属污染对土壤群落结构的影响，在我国农田土壤重金属污染日趋严重的背景下，本研究提出以长期重金属（Pb/Cd）污染的南方代表性地区的典型水稻土为研究对象，以重金属污染对土壤有微生物稳定性及微生物群落结构的影响机制为主要研究内容，利用稳定性 13C 同位素示踪、微生物群落结构分析（PCR-DGGE-高通量测序，PLFA）等技术，通过探讨重金属污染下水稻土生境改变下的土壤微生物生态过程和污染环境下农田土壤的碳评估和管理提供参考。

3. 研究的方法与方案

试验选择江苏省宜兴市宜丰桥两块临近水稻土为采样区，污染采样区的污染源为金属冶炼厂，当地年均气温15.7℃，年均降水量约为1200 mm，土壤类型为太湖地区第四纪湖积物发育的典型脱潜型水稻土——乌泥土。重金属污染水稻土：在2017年的小麦收获后，分别选取距污染源60m（p1）和10m（p2）的土样代表不同污染程度的土壤样品，并选取邻近未有明显污染源田块作为对照（p0）。对土壤样品进行基本性质测定及群落结构分析。

对培养后的土壤委托美格基因科技有限公司进行细菌和真菌群落结构分析，dna提取按照商业试剂盒（mp biomedicals，santa ana，ca）的说明，完成基因组dna抽提后，利用1琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组dna。提取样品总dna后，采用细菌16srrna v3-v4基因的通用引物：actcctacgggaggcagcag和ggactachvgggtwtctaat（zhou et al., 2011）。真菌18srrna基因(its1-its2)通用引物：cttggtcatttagaggaagtaa 和gctgcgtt cttcatcgatgc，合并引物接头，进行 pcr 扩增，并对其产物进行纯化、定量和均一化形成测序文库，文库质检合格后用于上机测序。测序方法采用illumina miseq pe350 双端测序，得到的原始图像数据文件，经碱基识别（base calling）分析转化为原始测序序列（sequenced reads）。

miseq 测序平台，利用双末端测序 paire-end 的方法，每条序列从 5’端和 3’ 端各产生 250（hiseq 2500）或 300bp（miseq）的 reads。在进行分析前需要对原始数据进行剪切过滤，滤除低质量的 reads，获得有效数据 clean reads；通过 pe reads 之间的 overlap 关系将 reads 拼接成 tags，进一步过滤获取目标片段（clean tags）；在给定的相似度下将 tags 聚类成 otu，然后进行otu物种注释，从而得到每个样品的群落组成信息。基于以上信息，计算样品的 alpha 多样性从而得知样品的物种丰富度和均匀度，同时利用 venn 图、花瓣图可以知道不同样品或不同分组间的共有和特有的 otu 信息等。基于 otu 代表序列构建系统发育树，结合物种丰度信息，通过 pcoa、nmds 等排序分析，可以进一步比较不同样品和分组的群落结构差异，相关结果可以降维图和聚类树等形式展示。通过 lefse、anosim、adonis 等统计分析方法可对分组样品的物种组成和群落结构差异进行统计检验。同时结合群落数据和环境因子数据进行关联分析。

4. 研究创新点

随着现代分子生物技术高速发展，本研究利用高通量测序技术，在分子水平上分析了不同程度重金属污染水平下稻田土壤群落结构差异，研究了不同程度重金属污染对土壤中不同菌群的影响，探讨了土壤中重金属耐性菌和敏感菌的变化，以期为重金属污染下水稻土有机碳稳定性机制的研究提供生物学方面的参考。

5. 研究计划与进展

1. 研究不同重金属污染对土壤群落结构的影响

2. 完成本科毕业论文