水稻氮素相关遗传材料的分子鉴定开题报告

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1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

课题意义（1）水稻是我国最主要的粮食作物，根据国家统计局数据，我国人口数量众多，水稻粮食作物的需求量也很高。2018 年国内水稻，根据 usda 最新预测，我国大米产量 1.42 亿吨，需求量将达到 1.44 亿吨，根据中国粮网数据，截至 2017 年底，全国累计水稻销量为 1.65 亿吨，实际的需求已经超过产量。很多地区为了提高水稻的产量，加大了化肥的使用。据资料统计，我国农作物化肥使用量增长迅速，从1980 年的1269.4 万吨增长到2014年的5995.9万吨, 增长了3.7倍，年均增长率为4.67。而在农作物化肥使用中，氮肥的用量相当大，约占全球氮肥总消费量的三分之一，稻田单季氮肥用量平均为180 kg /hm，比世界单位面积平均用量高出75左右，但施入农田中的氮肥被主要粮食作物利用的仅27.5。由于施氮量过高，导致氮肥利用效率低下，流失的氮释放到自然环境中而造成的一系列生态环境问题。所以，提高水稻的氮素利用效率对提高农作物产量以及对减少施肥总量有重要的意义。（2）筛选出分别含有水稻高亲和硝酸盐运输蛋白基因osnar2.1和osnrt2.3b材料为今后的进一步培育氮高效水稻品种研究打下基础 , 并提供研究材料和依据。国内外研究进展：fan等（2016），通过构建osnrt2.3b超表达的日本晴材料，发现osnrt2.3b的超表达转基因材料相较于野生型氮素利用和吸收效率明显增加，且株高和产量增加更为明显。陆海燕（2015）又构建了osnrt2.3b超表达的武运粳7号材料，结果发现osnrt2.3b的超表达材料相较于野生型株高增加明显，有效分蘖数增多，产量增加明显。陈景光（2016）用农杆菌介导ubiquitin (ubi)启动子在水稻日本晴中过量表达osnar2.1高亲和的硝酸盐转运蛋白,并在田间实验发现，与野生型相比，过量表达株系总分蘖数增加约70，生物量提高约27，整个生育期的生长速率都显著提高，在齐穗期和成熟期的氮素积累总量提高约20和18。应用前景：深入探讨水稻高效氮素营养内在的生物学基础，发掘和利用其遗传特性,培育和推广氮高效水稻新品种，同时采取适当的栽培农艺措施，减轻因氮素使用不当而造成的环境污染，使我国农业迅速走上高产、优质、高效和可持续发展之路。

参考文献

[1]陆海燕，李胜元等，超表达osnrt2.3b促进水稻武育粳7号生长和提高籽粒产量[j]，分子植物育种，2015(13)

[2]魏琳琳，氮高效转基因水稻osnrt2.3b壤氮素形态及氮素转化微生物的影响[m]，硕士学位论文，2017（5）

2. 研究的基本内容和问题

研究目标：通过分子鉴定技术pcr、southern blot对转基因材料双t4代进行鉴定筛选，希望获得只含有目的基因osnrt2.3b和osnar2.1但不含有潮霉素基因的氮高效水稻种质。

研究内容：通过pcr技术对转基因材料进行初步筛选，选出只含有目的基因不含潮霉素的转基因材料，再通过 southern blot 技术对初步筛选出的转基因材料进行进一步验证。

拟解决的关键问题：该研究中获得的氮素水稻材料经过农化杆菌转化法转入了目的基因和标记基因，而标记基因一般为抗生素抗性基因，对环境和食品存在着潜在的不安全性，需要通过分子鉴定技术获得不含标记基因但含目的基因的材料。

3. 研究的方法与方案

研究方法： pcr; southern blot技术路线：如附件实验方案3.1 八卦洲基地采样驱车前往八卦洲实验基地，在水稻小区里，采取目标水稻分蘖期穗下第一二叶，装入管中，进行编号，带回实验室，零下二十度冷藏，备用。

3.2 提取转基因水稻株系的dna（1）水浴锅预热65℃、预热dna提取液（2）剪碎0.2g新鲜叶片放入提前转入钢珠的2ml离心管中，液氮预冷离心管，取出后用均质仪进行叶片破碎（3）倒出钢珠，并在每管中加入500μldna提取液并剧烈涡旋，混匀（4）离心管65℃水浴15至20分钟，取出后每管加入500μl，然后振荡使其混合均匀（5）放入离心机，设置为12000prm，10min（6）用200μl移液枪将每管的上清液取出，移到1.5ml离心管中（7）每管加入500μl异丙醇，混合均匀后放置在-20℃冰箱中10分钟（8）取出后放入离心机中，设置为7200prm,10min（9）观察管底是否出现白点，否则重复前面步骤（10）将管内的上清液倒了，并用移液枪将残留液体也移出，然后加入750μl无水乙醇（11）放入离心机，设置为7500prm，10min,取出，用移液枪将残余上清液移出，然后加入50μlddh o3.3 pcr鉴定操作步骤：（1）反应管中加如dna、dntp、10x buffer、primer、taq酶、去离子水等反应物。

（2）用微量移液器充分混匀．离心10s，收集反应物至离心管底部。

4. 研究创新点

特色或创新之处利用双T载体进行转基因，用于获取不含有标记基因的转基因后代，选育和培育氮高效水稻种质

5. 研究计划与进展

研究计划1.实验前期准备工作 2018年9月3日-2018年11月3日 2.按照试验方案开展实验 2018年12月15日-2019年3月18日 3.实验数据结果分析、总结 2019年4月1日-2019年4月30日 4.撰写相关研究报告 2019年5月1日-2019年5月15日 预期研究成果：撰写毕业论文1篇，数据资料，图片资料若干。