根系特异性启动子驱动NRF基因表达对水稻铵营养及根构型的影响开题报告

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1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

意义： 根系是植物从土壤中吸收营养的主要器官。因此根系的发育水平决定了植物对营养的吸收能力。根系生长及构型变化受到多种因素的影响。其中包括光照及昼夜变化。光照可以促进根系的生长，超表达光周期基因改变根系构型，继而影响植物对矿质营养元素的吸收，从而改变植物的生长发育，解析改变根构型的机制。通过转基因拟获得吸收高效的材料，为获得营养吸收高效的品种提供理论支持和实际应用参考。国内外研究概况：1.水稻根系相关研究 水稻是一种重要的粮食作物，养育着全球一半多的人口。由于人口压力及其导致的粮食压力和生态压力，在目前乃至未来一段时间内稳定、可持续的提高水稻产值仍是水稻研究者的优先任务。而水稻生长发育和养分吸收离不开良好的根构型。 根系形态构型与性状直接关系到稻株的营养状况，特别是吸氮能力养分吸收能力。在稻株摄取氮素养分的过程中，根系参数的改变起到了决定性的作用。因此研究根的形态学特征有着重要的意义。水稻根构型受多种因素影响。最主要的影响因素是内源基因，借助国际水稻全基因组测序计划研究成果，国内外水稻分子生物学家分别发现和克隆了许多与根系形态特征、生物学作用相关的基因。如控制水稻短根基因fpf1、不定根形成基因arl1和根冠形成基因wox11等[1]。 水稻根系形态也受外源环境的调控，如根际含氧量、温度、水含量、矿质元素等。激素也是影响根系生长的重要环境因素之一，其中生长素（aux）是影响根形成的主要激素，对根起着关键性作用。此外乙烯(eth)、细胞分裂素(ctk)、赤霉素(ga)和脱落酸(aba)等也在根形成中发挥不同作用[2]。2.生物节律相关研究 植物体内存在生物节律钟，可以对昼夜光周期变化作出响应适应各种外部环境。生物节律钟通过测量日长和夜长确定开花时间[3]。生物节律钟是通过生物节律基因和蛋白相互作用联系来实现的，由一个中心反馈环和两个侧向反馈环组成。拟南芥的中心反馈环由2个myb家族的转录因子circadian clock-associated 1 (cca1)和late elongated hypocotyl(lhy)和prrs家族的转录抑制因子timing of cab expression 1 (toc1)组成的[4]。由于生物钟基因在植物进化中非常保守[5]，且nrf与lhy同属于r2/r3类myb转录因子家族，可以猜测nrf基因也有类似功能，本课题的前期试验证明这一假设。3.生物节律对根系影响 生物节律钟基因对植物生长发育的许多过程有调控作用[6]。在拟南芥中，生物节律钟活性与代谢活力有关,生物节律钟活性可以促进或抑制许多重要激素的含量，如赤霉素(ga)、茉莉酸（ga）和脱落酸(aba)等，从而影响植株的整个生长发育过程[7]。国外研究表明tic（time for coffee）可以调控生长素的运输影响根系生长。敲除这一基因可以抑制了顶叶生长素转运的pin基因的表达，导致生长素在负责减少根分生组织的根系中积累较低[8]。cca1可以调控生长素的横向运输干预侧根生长[9]。国内也有关于拟南芥tic通过调节生长素聚集影响根分生区发育的报道[10]。 对此我们做出假设，生物节律基因可能通过调控植株体内激素含量进而影响植物的生长发育，并对此设计相关试验验证。

生物节律钟基因对多种农艺性状的贡献[7]

应用前景 植物生长是在时间和空间上的，内源和外源因素相互影响的繁复杂过程[11]。了解生物节律钟，不仅有利于了解植物生长发育的本质，还对实践具有指导作用。水稻是中国南方最主要的粮食作物，关乎着中国的粮食安全问题。氮是植物最主要的矿质营养，对缺氮稻田施用氮肥获得明显增产效果[12]。但目前靠单纯增施氮肥提高产量的潜力已被充分挖掘，在中国尤其是南方地区存在着氮肥施用过多造成的问题，包括氮肥利用率低，水体富营养化，土壤退化，产量降低。通过其他手段提高植物的氮的利用效率并获得最大产量是目前的研究热门。 由于生物节律钟基因可以调节开花期，因此对植物营养及产量有影响。本课题通过研究生物节律钟基因强表达对于氮营养和根构型的影响，探讨通过改良生物节律钟提高作物产量的可能性。1.梁永书,周军杰,南文斌,段东东,张汉马.水稻根系研究进展[j].植物学报,2016,51(01):98-106.2.王金祥,严小龙,潘瑞炽.不定根形成与植物激素的关系[j].植物生理学通讯,2005(02):133-142.3.yanovsky mj and kay sa. 2002.molecular basis of seasonal time measurement in arabidopsis. nature, 419: 308~312.4.baudry a, ito s, song yh, strait aa, kiba t, lu s, henriques r, pruneda-paz jl, chua nh, tobin em, kay sa, imaizumi t. 2010. f-box proteins fkf1 and lkp2 act in concert with zeitlupe to control arabidopsis clock progression. plant cell, 22(3), 606~622.李佳,刘运华,张余,陈晨,余霞,余舜武.干旱对水稻生物钟基因和干旱胁迫响应基因每日节律性变化的影响[j].遗传,2017,39(09):837-846.6.bendix c, marshall cm, harmon fg . circadian clock genes universally control key agricultural traits.mol plant. j 2015 aug;8(8):1135-52.7.ni et al., 2009.altered circadian rhythms regulate growth vigour in hybrids and allopolyploids. nature, 457 (2009), pp.327~331.hong lw, yan dw, liu wc, chen hg, lu yt. time for coffee controls root meristem size by changes in auxin accumulation in arabidopsis. j exp bot. 2013;65(1):275-86.9.ruts t, matsubara s, wiese-klinkenberg a, walter a.aberrant temporal growth pattern and morphology of root and shoot caused by a defective circadian clock in arabidopsis thaliana.plant j. 2012 oct;72(1):154-61.10.洪礼伟. 拟南芥tic通过调节生长素聚集影响根分生区发育[d].武汉大学,2013.11.李彦旭,王浩,颜睿,闫海芳.生物节律相关基因及其在农业与健康上的功能[j].黑龙江农业科学,2019(01):160-166.12.叶全宝,张洪程,魏海燕,张瑛,汪本福,夏科,霍中洋,戴其根,许轲.不同土壤及氮肥条件下水稻氮利用效率和增产效应研究[j].作物学报,2005(11):38-44.

2. 研究的基本内容和问题

研究目标：1.阐明根系特异性启动子启动NRF对水稻氮吸收的影响。2.阐明根系特异性启动子启动NRF对水稻根构型的影响。3.探究NRF基因对根构型变化的作用机制。4.完成毕业论文。研究内容：1.构建NRF基因根部超表达材料。2.研究根系特异性启动子启动NRF对水稻铵营养及根构型的影响。3.NRF基因对铵态氮、硝态氮转运蛋白的影响。4.NRF基因对激素的影响。拟解决的关键问题：

1确定水稻氮营养和根构型对NRF基因超表达的响应。

2探讨生物节律钟对水稻生长发育的影响。

3. 研究的方法与方案

研究方法：1.nrf根系超表达材料的验证2.nrf超表达对水稻根系吸收nh4 、no3的影响3.供n形态和浓度对nrf基因的表达影响极其检测方法4.水稻根构型分析5.nrf超表达对激素相关基因的表达影响极其检测方法技术路线实验方案1.实验材料的验证 培养水稻幼苗，将幼苗的根和叶截取1-2cm小段浸泡于5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸(x-gluc)。若组织细胞发生了gus基因的转化，并表达出gus，在适宜的条件下，该酶就可将x-gluc水解生成蓝色产物。观察染色部位并拍照。2.供n形态和浓度对nrf基因的表达影响极其检测方法 将野生型水稻以全营养液培养两周后缺n处理（其他营养浓度不变）三天，再分别移入对应n处理的底部遮光罐子中。不同n浓度处理包括0.25mm、2.5mm和10mm。不同n形态处理包括铵态n、硝态n、铵硝混合。每种处理中n浓度都为2.5mm。利用rt-qpcr分析其基因的表达变化。3.敲除nrf对水稻根系吸收nh4 、no3的影响 15n标记的10min瞬时吸收实验：为研究nrf在根部超表达后对水稻n吸收速率的影响，将nrf根系超表达材料和野生型植株分别在含有0.125mm (15nh4)2so4、0.125mm ca(15no3)2、1.25mm (15nh4)2so4以及1.25mm ca(15no3)2的营养液中吸收10min。 15n标记的长时间吸收实验：将nrf根系超表达材料和野生型植株分别在含有0.125mm (15nh4)2so4、0.125mm ca(15no3)2、1.25mm (15nh4)2so4以及1.25mm ca(15no3)2的营养液中吸收24h。

为防止n转移，处理完毕即迅速将根与地上部分离，在700c烘箱中烘干称重，取根系进行15n测定。最后分别计算单位根重及总根系吸收n总量。4.水稻根构型分析 nrf根系超表达材料在以硫酸铵为n源（n浓度分别为0.25mm, 2.5mm以及10mm）的营养液条件下培养两周后，用根扫描仪统计根构型相关数据。5.nrf超表达对激素相关基因的表达影响极其检测方法 两周大nrf根系超表达材料（培养条件同5）利用rt-qpcr分析与激素相关基因的表达变化。

可行性分析（1）从试验设计考虑，目标明确，思路规范，设计合理，研究方案比较科学，操作性较强。（2）从试验操作考虑，本试验采用的试验操作基因表达分析、组织细胞学观察等技术均已在水稻中成功运用，并且在实验室有使用的经验。（3）从实验材料分析，通过前期工作已经获得根部特异性启动子启动nrf基因的植株，并且经过验证。保证后续实验的可行性。（4）从小组成员考虑，本小组成员均就读于资环学院，专业知识扎实，并且都能熟练使用excel，spss等统计学软件，可以正确的分析并且解决问题。

4. 研究创新点

前人的研究大都止于模式植物——拟南芥开花对于生物节律钟相关基因的响应，很少有关于水稻生物节律钟基因的研究，更是很少有研究将物节律钟相关基因与矿质营养联系起来。

本研究将生物节律钟相关基因与水稻氮营养和根构型联系起来，提出并验证一个新的基因NRF对水稻铵营养及根构型的影响，探索生物节律钟影响水稻生长发育，尤其是氮营养的可能性。

5. 研究计划与进展

2018.1-2018.3 验证所获得的水稻材料，gus染色并拍照2018.4-2018.9 在不同氮营养及浓度下培养水稻幼苗，记录开花性状，测量nrf基因表达量。

2018.10-2019.1 重复上述实验，记录根构型，测量n吸收速率、氮含量。

2019.1-2019.5 测量pin等基因表达量，分析相关性。