贵州木霉NJAU4742内切葡聚糖酶基因eg-II的毕赤酵母异源表达及其酶学性质研究开题报告

全文总字数：6951字

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

本课题的意义：

纤维素是目前世界上已知分布最广的碳水化合物，也是世界上总量最大的可再生资源。据报道，每年大概全球会产生干重为 1.3×10¹³万吨的陆生植物。其中，纤维素占所有植物干重的50%。如能将这些纤维素水解转化为具有经济潜力的生物多糖，不仅有利于环境保护，还可解决能源、粮食、环境等一系列问题。纤维素的利用具有重大的意义和价值，但是技术上的制约使得绝大部分的纤维素无法被直接利用。而酶法降解天然纤维素作为一种重要的分解纤维素的方法已被深入研究^[1-3]。

本研究采用合适的表达系统单独表达贵州木霉njau4742酶系的纤维素酶，经过微生物培养后，采用rt-pcr的方法从该木霉中分离到内切葡聚糖酶基因eg-ii，将此基因与毕赤酵母表达载体连接，得到重组质粒，采用电转移法进行重组质粒在毕赤酵母的转化，重组内切葡聚糖酶基因eg-ii在毕赤酵母中的诱导表达后，进行酶活及蛋白质含量测定。从而达到提高木霉的纤维素酶活性促进纤维素的降解，达到改善农业固体废弃物资源化利用的目的。

2. 研究的基本内容和问题

研究的目标：

通过外源表达手段构建重组毕赤酵母实现贵州木霉njau4742内切葡聚糖酶基因eg-ii的高效表达，提高其纤维素酶的活性，促进纤维素的降解，提高农业固体废弃物资源化利用的效率。

研究的内容：

3. 研究的方法与方案

研究方法：

1、微生物培养

木霉培养基（pda、含稻草粉的mandeils培养基）、大肠杆菌培养基（lb）、毕赤酵母培养基（ypd、mmh、mdh、bmgy、bmmy）组成成分参见invitrogen公司的毕赤酵母表达系统操作手册，重组质粒的筛选时lb培养基需加入25μg/ml zeocin，在筛选重组毕赤酵母菌株时ypd培养基需加入100μg/ml zeocin。在37℃，200 r/min的旋转式摇床上进行大肠杆菌的培养。在30℃，250 r/min的条件下进行毕赤酵母的培养。

4. 研究创新点

特色或创新之处

纤维素的降解有两条途径，即化学法和生物酶法，但化学法特异性差、纯度低、污染环境，而用生物酶法可克服这些缺点。目前常用的生物酶是纤维素酶，但天然的微生物生产纤维素酶还存在许多问题，如酶产量低、酶活性低、受到葡萄糖等产物的反馈抑制等，这些问题极大的影响了纤维素酶的应用。通过外源表达手段构建重组毕赤酵母实现贵州木霉NJAU4742内切葡聚糖酶基因EG-II的高效表达，提高其纤维素酶的活性，促进纤维素的降解，对提高农业固体废弃物资源化利用有重要的意义。

5. 研究计划与进展

研究计划及预期进展

2018月2月至3月：查阅文献，制定研究计划，实验步骤；

2018月3月至4月：木霉培养，分离目标基因，进行表达载体的构建和毕赤酵母的电转化；