贵州木霉NJAU4742在低pH胁迫下碳源利用特性及其机制研究开题报告

全文总字数：19586字

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

1.课题的研究意义

过量施用化肥、农药等化学品使我国土壤微生物区系受到极大破坏，土壤养分生物转化能力越来越弱，作物产量对化肥供应养分的依赖性越来越强，经济作物的土传病害更严重，严重影响了我国农业的可持续发展^[1]。近年来，哈茨木霉因其具有显著的促进植物生长或防控土传病害的能力以及环境友好、安全无毒的特点，在农业生产上得到越来越广泛的应用^[2]。哈茨木霉定殖于植物根部后能与植物形成共生体，显著促进根际养分的转化并通过分泌次级代谢产物和植物生长调节剂来促进植物的生长^[3-5]，有效地施用哈茨木霉菌株及其相关产品，也是减少我国农用化学品投入的重要途径之一。目前，木霉生物有机肥制备技术的瓶颈主要是，很难像芽孢杆菌那样进行大规模的二次固体发酵（不耐高温），而浅盘固体发酵又很容易被其他的杂菌污染；另一方面，固体发酵过程中哈茨木霉有限的秸秆分解能力导致木霉固体发酵效果不佳。研究表明，通过调节固体基质的ph（5.0）可以显著提高哈茨木霉秸秆中木质纤维素的分解效率，增加其分生孢子的产量^[6]，但是其具体的生物学机制还鲜有报道。因此，研究低ph条件下哈茨木霉纤维素酶系的分泌调控机制，不仅是本领域的重要科学问题，对提高木霉生物有机肥的生产效率和增强田间施用效果具有更重要的理论意义，也是本项目所要阐明和揭示的科学与技术问题。

2 国内外研究进展

2. 研究的基本内容和问题

1.课题的研究目标

（1）利用生物信息与蛋白组学方法，表征低ph条件下野生菌株wt和突变菌株m3胞外木质纤维素酶分泌特性；

（2）利用分子生物学和酶学方法，解析低ph条件下调控通路中关键基因在耐酸和木质纤维素酶分泌过程中的功能。

3. 研究的方法与方案

1.研究方法及实验方案

第一部分低ph条件下突变株m3木质纤维素分解特性研究

（1）菌株的突变与筛选（已完成）

4. 研究创新点

1.本课题的特色

目前，国内外关于丝状真菌耐酸机制研究还比较少，还鲜有针对其在低ph条件下木质纤维素酶分泌调控机制的研究。本申请项目以本课题组前期分离获得的一株高效植物有益菌哈茨木霉njau4742，采用了基因突变、基因编辑、酶学、蛋白组学等技术研究其耐酸与木质纤维素分解的耦合关系，为揭示其在低ph条件下分解木质纤维的机制提供坚实的理论基础。

2.本课题的创新性

5. 研究计划与进展

1.研究计划

2019.3-2019.4：计划完成野生株wt和正向突变子m3的秸秆分解试验，分析秸秆分解过程总碳、氮，水溶性碳、氮，纤维素、半纤维素和木质素含量；利用扫描电镜和原子力显微镜观察代表新秸秆表面和微域的形态结构变化；利用利用¹³c核磁共振的方法研究主要碳组分的变化；通过以上试验来比较两个菌株在低ph条件下秸秆分解的能力。计划完成野生株wt和正向突变子m3低ph条件下分解秸秆胞外蛋白组学的分析，揭示两者胞外酶系的分泌特征；完成正向突变子m3全基因组的测序、注释以及突变位点的分析。

2019.4-2019.5：计划完成“调控假说”中中关键基因sah2，parp单基因的敲出；完成正向突变子m3中关键基因的单基因敲除；利用多基因编辑方法，对正向突变子m3中关键基因进行多基因逐一敲除，构建与向突变子m3相似功能的菌株；完成不同突变子耐酸能力与木质纤维素能力的评价，解析sah2，parp基因的转录特征。计划完成sah2，parp免疫共沉淀实验，阐明两个基因转录调控关系，揭示在低ph条件下哈茨木霉木质纤维素酶分泌调控的机制；完善研究内容，根据需要补充试验；统计资料、撰写论文并做好结题相关工作。