堆肥中筛选出的嗜热可培养真菌在不同碳源中联合培养的胞外蛋白分泌差异的研究开题报告

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1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

我国，近年来，年产各类作物秸秆6亿多吨，而预计至2021年年末，我国脱水污泥年产量将超过4200万吨。农业废弃物资源污染和浪费问题日趋严重，已经成为世界各国共同面临且亟需解决的问题。利用微生物的氧化还原和合成能力，可将废弃物里有机质分解为腐殖质或合成有效态矿质元素，形成绿色、稳定、安全的有机肥。堆肥化是实现农业废弃物无害化、减量化处理有效而经济的重要措施。而微生物是加快有机固体废弃物分解速度的关键，是堆肥化处理重要的生物因子。

农业废弃物在堆肥过程中的腐熟降解是由微生物作用发生的，有资料表明可高效降解农业废弃物的菌种达上百种，主要包括纤维素降解菌、半纤维素降解菌和木质素降解菌。决定腐熟农业废弃物高效降解的关键在于纤维素降解菌、半纤维素降解菌和木质素降解菌的配比[1]。有研究者发现, 在好氧堆肥过程中 ,对这几类有机物质具有降解能力的微生物主要是高温放线菌和高温真菌[2]。徐春钰等［3］研究发现在蔬菜花卉秸秆中添加微生物菌剂后，堆肥迅速启动，进程加快，有机肥质量得到提高。冯海玮等［4］研究发现水稻秸秆添加灰略红链霉菌后，堆体温度迅速上升，发酵时间明显缩短。

在环境保护中的应用前景和未来非常广阔。随着经济的快速发展，人们对生活环境的要求也越来越高，农业废弃物循环利用成为了人类迫切需要解决的重大问题之一。通过农业废物堆肥化处理技术，能够实现农业废物的环保、健康和高效的处理手段。堆肥过程中通过添加微生物能够提高效率，促进代谢，去除有害物质，形成有机肥。堆肥化过程中,真菌对堆肥物料的分解和稳定起着重要的作用,真菌不仅能分泌胞外酶,水解有机物质,而且由于其菌丝的机械穿插作用,还对物料起一定的物理破坏作用,促进生化反应。嗜热真菌通常存在于堆肥、干草堆和碎木堆等高温环境中，有助于一些有机物的降解。利用嗜热菌对废水废料进行厌氧处理，可提高反应速度，消灭污水污物中的病原微生物。

2. 研究的基本内容和问题

研究从堆肥中筛选出的嗜热可培养真菌在不同碳源中联合培养的胞外蛋白的分泌差异情况。

堆肥化过程中,真菌对堆肥物料的分解和稳定起着重要的作用，真菌不仅能分泌胞外酶水解有机物质而且由于其菌丝的机械穿插作用,还对物料起一定的物理破坏作用.促进生化反应。温度是影响真菌生长的重要因素之一,一些中温类群包括嗜热真菌和耐热真菌在升温的前几天就很快被杀死;一些高温期结束后很快出现的真菌如嗜热毛壳霉,它能快速利用纤维素和半纤维素且生长迅速;还有一些是在高温结束后一段时间即堆温下降阶段出现它们包括两个嗜热真菌三个中温真菌和三个担子菌。据文献记载真菌一般在40-50℃活跃，温度60℃,真菌几乎完全停止活动,死亡或处于休眠状态。有研究证实堆肥温度45℃时主要菌株包括:曲霉属,芽孢杆菌属,肠道杆菌属,假单孢菌属和芽孢乳杆菌属。由于在堆肥过程中各种环境因素都是在不断变化,因此,在不同的堆肥环境中分离的微生物在分类学上具有多样性

嗜热真菌生长的温度特征决定了它们分离培养的关键, 即对两个温度 (50℃和19℃) 的控制, 尤其19℃这一下限温度更为重要, 只有在19℃及其以下温度范围不能生长者, 才能确定为嗜热真菌。嗜热真菌分离培养的技术线路如下:标样→培养基→45℃~50℃培养→生长菌株进行纯化→19℃及其以下温度培养→不生长菌株确定为嗜热真菌。将确认为嗜热真菌的菌株切取长有菌丝的培养基小块, 移植到斜面培养基上, 并放到45℃~50℃培养箱内培养4~7d, 充分生长后, 于4℃冰箱中长期保存。

3. 研究的方法与方案

从高温堆肥中筛选出5株嗜热可培养真菌，最适温度在45℃左右，把菌株在适宜且共同的条件下进行培养扩繁，然后将菌株接种到水稻、棉花、ph101三种碳源上进行液体发酵。4天后用4层纱布把菌株和未分解的碳源物质过滤下来，并保存滤液，用1%的氢氧化钠溶解菌丝测生物量，其与菌丝蛋白浓度成正比。将滤液过0.45um的水性膜，剩下的液体在1万转、4℃下进行离心10分钟，所得到的上清液即为粗蛋白，将其稀释20倍，用硫酸铵处理，再用透析袋透析其中的盐类，降低盐浓度，24小时内换液3-4次，即可得到浓缩后的胞外蛋白，将其用1.5ml离心管分装并保存在-80℃的冰箱里，待以后测定，剩下部分大概10ul左右用银染蛋白胶银染并送公司检测。

好氧堆肥是以好氧菌为主对有机废物进行吸收、氧化、分解,微生物通过自身的生命活动,把一部分被吸收的有机物氧化成简单的无机物并放出生长活动所需的能量,把另一部分有机物转化合成为新的细胞物质,使微生物生长繁殖产生更多的生物体。好氧堆肥系统温度一般为50～60℃,最高可达80～90℃。

如今,嗜热微生物已成为国际研究的热门领域, 日本、美国, 欧洲等国家都启动了嗜热微生物研究计划, 在揭示高温生命形式的奥秘、并利用其特殊机制与特殊产物方面的努力和竞争已形成国际趋势。嗜热真菌是生物多样性中重要的组成成分, 因其在高温条件下的热稳定性和高活力, 可广泛应用于酿造、发酵、食品、日用化工、纺织、制革、医药、废物处理等领域中, 近年来其特有的基因序列和功能的研究已获得可喜进展。我国境域辽阔, 地形地貌复杂, 气候类型多样, 被列为世界上高度生物多样性的12个国家之一, 因而存在嗜热真菌分布和生存的各种气候条件和生境条件。并且已有很多关于纤维素分解菌的报道,其大部分是以纯培养方法分离和筛选。部分嗜热真菌也可通过人工培养方式扩增。

4. 研究创新点

首先是实验材料，研究的是堆肥中筛选出的嗜热可培养真菌，目前国内外这方面的研究尚且不多且不是很成熟，有一定的创新。其次利用不同的碳源进行联合培养来比较嗜热真菌胞外分泌蛋白的种类差异。

5. 研究计划与进展

3.1-3.16，进行嗜热真菌的培养扩繁以及检测

3.17-4.1，进行将嗜热真菌接种到不同碳源里并培养

4.1-4.15，进行菌丝蛋白检测以及透析并得到浓缩的胞外蛋白