重庆市马尾松枯死木一株线虫分离物的鉴定与检测开题报告

1. 研究目的与意义

随着松材线虫对我国部分地区松树的毁灭性危害，人们越来越重视松树寄生线虫与松树的健康关系。

到目前为止，在我国松树上已经发现寄生线虫有11属的40种以及11个未定种。除松材线虫外，一些线虫如拟松材线虫、b.sexdentati等能够引起某些松树的死亡。我国松林分布区寄生线虫的分布状况以及这些寄生线虫对松树的致病性、生物学特性、与媒介昆虫和寄主的相互关系等等一系列问题还不十分明确。如何对松树体内这些优势线虫种群进行鉴定和区分，是检疫实践上亟待解决的问题。

本文拟对来自重庆市马尾松枯死木内分离的一株线虫的种类进行形态鉴定，期望摸清华山松体内寄生线虫的情况。并开发相应的分子检测技术，以便为松树检疫性有害生物管理决策提供参考，为林业生产实践提供技术支撑。

2. 国内外研究现状分析

随着分子生物学的飞速发展及其在病原生物分类及检测中的广泛应用（胡稳奇,1994;焦振泉等,1996;韦革宏等,1999;翁康生等,2002），分子生物学技术也逐渐被应用于植物线虫分类学(周国梁,1996;郑经武等,1996,1998;王新荣等,2001;汪江一等,2006)，新的分子检测技术不断被发展（贺水山等,2002;张卫东等,2005;肖方震等,2005），在许多部门尤其是检疫系统，传统的显微镜观察鉴定方法已逐渐被分子检测技术所取代（perrymoens,2006）。

目前植物线虫分子标记的主要方法有限制性片段长度多态性（rflp）、rapd标记、scars（sequencecharacterizedamplifiedregions）标记、微卫星（simplesequencerepeats,简称为ssr）dna多态性技术、aflp(amplifiedfragmentlengthpolymorphism)技术、核酸分子杂交（molecularhydridization）技术、实时定量pcr技术等。在松材线虫的检测方面，实时定量pcr技术发挥了巨大的作用。

2000年，日本的荣研株式会的notomit等人开发出来的一种新的核酸扩增方法，即环介导等温扩增技术（loop-mediatedisothermalamplification，简称lamp）。lamp技术是针对靶基因的6个区域设计4种特异的引物，利用一种链置换dna聚合酶（bstdnapolymerase）在恒温条件（65℃左右）保温几十分钟，即可完成核酸扩增反应，具有高特异性和等温快速扩增的特点，可以在1h之内，将靶dna片段扩增109～1010倍。在dna延伸合成时，从脱氧核酸三磷酸基质（dntps）中析出的焦磷酸离子与反应溶液中的镁离子结合，会产生一种焦磷酸镁的衍生物，而高效扩增的lamp法生成大量这样的衍生物，并呈现白色沉淀。可以把浑浊度作为鉴定指标，只要用肉眼观察白色混浊沉淀，就能鉴定扩增与否，而不需要繁琐的电泳和紫外观察等过程。因为lamp反应不需要pcr仪和昂贵的试剂，所以利于在一些基层机构的应用，有着极为广泛的应用前景。

3. 研究的基本内容与计划

1、2011.02.16―2011.03.08：查阅文献，做预备实验；

2、2011.03.09－2011.03.22：松木样品收集；

3、2011.03.23－2011.04.15：线虫收集、培养、固定；

4. 研究创新点

1、开发相应的分子检测技术，以便为松树检疫性有害生物管理决策提供参考，为林业生产实践提供技术支撑。

2、本研究将为提高检疫检验技术方法，进一步控制松树病害提供理论依据与技术支撑。