拟松材线虫环介导的恒温扩增(LAMP)检测技术开题报告

1. 研究目的与意义

拟松材线虫是由日本学者Mamiya于1979年首次分离发现的一种松树寄生线虫，拟松材线虫是松材线虫的同属近似种。拟松材虫病20世纪80年代陆续在一些省区松林中发生，其危害十分严重，已造成大量松树枯死，对森林资源的发展构成严重威胁。拟松材线虫对松树健康的影响越来越受到人们的关注。目前研究开发出的分子鉴定方法有很多种，但都存在一定的缺陷。如基于PCR的分子检测方法需要昂贵的变温循环装置等。本研究旨在探讨一种新的检测技术，一方面能够快速区分拟松材线虫与其它线虫，便于生产上应用。另一方面也为其它病原物的检测提供方法上的参考。

2. 国内外研究现状分析

在我国，拟松材线虫主要分布于辽宁、上海、江苏、浙江、安徽、江西、山东、湖南、广东、广西、四川、贵州、云南等省(区、市)，并在局部地区造成了较重危害（杨宝君，1995），而且拟松材线虫对长势弱及濒死木具有较强的致病力，目前拟松材线虫对成过熟林已造成大面积危害及重大的经济损失，同时又破坏了生态环境的现实。目前研究开发出的分子鉴定方法有很多种，随着分子生物学技术的发展，核酸扩增法已经被广泛应用于病原微生物的鉴定，LAMP法(即环一媒恒温核酸扩增方法)就是近几年发展起来的新技术之一。2000年，Notomi等开发出一种新的DNA环介导的恒温扩增法(1oopmediatedisothermalamplifieationofDNA，LAMP)。其优势是特异性、灵敏度高，检测时间短等。该方法已经广泛应用于快速检测许多种类病原物，包括病毒，细菌，真菌，寄生虫，并取得了理想的结果，如在2003年Maruyama等首次采用LAMP方法检测了E．ColiO157：I-t7027的stx2基因，取得了理想的结果。但检测植物寄生线虫的研究并不多，在近几年有所涉及对线虫的检测，如在2009年Kikuchi，T等在多种线虫DNA中，针对松材线虫核糖体DNA内部转录间隔区设计的特异性引物，利用LAMP方法，鉴定出了松材线虫；在2011年Niu，Jun-hai等利用环介导恒温扩增对四种根结线虫进行检测。但是用恒温扩增(LAMP)检测拟松材线虫的研究并不多，需要进一步研究。

3. 研究的基本内容与计划

1、2012.02.16―2012.03.06：查阅文献，做预备实验；

2、2012.03.07－2012.03.20：拟松树寄生线虫培养；

3、2012.03.21－2012.03.26：拟松树寄生线虫dna提取；

4. 研究创新点

1、环介导的恒温扩增(lamp)方法已经广泛应用于快速检测许多种类病原物，包括病毒，细菌，真菌，寄生虫，但检测植物寄生线虫的研究并不多，本文采用环介导的恒温扩增(lamp)方法鉴别多种松树寄生线虫，能够快速区分拟松材线虫与其它线虫，便于生产上应用，也为其它病原物的检测提供方法上的参考。

2、本研究将为提高检疫检验技术方法，进一步控制松树病害提供理论依据与技术支撑。

3、lamp方法本身具有很多的优越性：高灵敏度；实验装置简单，费用低；反应产物的检测简单；特异性强；检测时间短。