植物磺肽素（PSK）对杉木体胚发生的影响开题报告

1996年，Matsubayashi和Sakagami用芦笋(Asparagus officinalis)叶肉细胞悬浮培养时，发现其中存在一种活性因子，通过高压液相色谱（HPLC）和快速原子轰击质谱法(MS)鉴定了其分子结构，命名为植物硫酸酯化激动素（PSK）。Matsubayashi等在实验中用化学方法合成了PSK-α，并将其加入到低密度植物细胞培养液中，进一步证明PSK-α可以促进不同密度的植物细胞的生长和增殖。之后在多种植物中发现PSK-α的存在，说明PSK-α有可能广泛存在于不同植物中。

（1）胚性胚柄细胞团（ESM）起始诱导

以DCR为基本培养基，附加2,4-D 2~6 mg/L，6-BA 0.5~1.0mg/L，KT 0.5mg/L，Vc 10 mg/L，L-Gln 0.45 g/L，水解酪蛋白0.5 g/L，麦芽糖15g/L，Ac 2.5g/L，水晶洋菜2.3 g/L。

在培养基中添加对应浓度梯度的PSK-α(如0，0.01，0.1，1.0 mgL^-1)，观察不同PSK-α浓度下培养细胞的发育情况，记录下体胚发生过程中各阶段的细胞团总数，确定PSK-α对体胚诱导的影响。

（2）EMS的维持与增殖

以DCR为基本培养基，但将生长素浓度降低。附加2,4-D2~6 mg/L，6-BA 0.5~1.0mg/L，KT 0.5mg/L，Vc10 mg/L，L-Gln 0.45 g/L，水解酪蛋白0.5 g/L，麦芽糖15g/L，Ac 2.5g/L，水晶洋菜2.3 g/L的固体培养基，继代周期25天，23℃，暗培养。

在培养基中添加对应浓度梯度的PSK-α(如0，0.01，0.1，1.0 mgL^-1)，观察体胚增殖速率，确定PSK-α对体胚维持与增殖的影响。

（3）体胚的发育与成熟

①直接体胚发生

将继代20天左右的增殖培养基上的EMS团直接平铺到体胚成熟培养基上进行萌发。

②间接体胚发生

1. 液体悬浮培养

以DCR为基本培养基，附加2,4-D0.5~2 mg/L，6-BA 0.2mg/L，谷氨酰胺0.45 g/L，水解酪蛋白0.5 g/L，麦芽糖30 g/L。培养细胞的初始密度为1.20%，摇床转速为85~90r.p.m，23℃，暗培养，增殖培养的时间控制为7天左右。

2. 体胚的成熟培养

以DCR为基本培养基，附加3~8 mg/L ABA和1~5 mg/L 赤霉素GA₃，活性炭2 g/L，水晶洋菜2.8 g/L。为了调节渗透压，添加聚乙二醇（PEG）100~200 g/L，另外加入试剂级纯度的麦芽糖25 g/L，谷氨酰胺0.45 g/L，水解酪蛋白0.5 g/L，脯氨酸0.2g/L，天冬氨酸0.2g/L。体胚的成熟培养时间控制为60-80天，23℃，暗培养。

在培养基中添加对应浓度梯度的PSK-α(如0，0.01，0.1，1.0 mgL^-1)，观察体胚发生频率和褐化现象，确定PSK-α对体胚发育和成熟的影响。

（4）体胚萌发成苗。

将发育成熟的体胚转移到DCR基本培养基进行培养萌发，即可实现植株的再生和培育成苗。

在培养基中添加对应浓度梯度的PSK-α(如0，0.01，0.1，1.0 mgL^-1)，观察体胚萌发率，确定PSK-α对体胚萌发成苗的影响。

植物磺肽素（PSK），是新近在植物中发现的硫酸酯化的短肽类生长调节物质。体细胞胚胎发生是细胞工程中植株再生的重要途径之一，是21世纪木本植物快速高效繁殖的最有效手段。

在本实验中，添加PSK可以有效提高杉木体细胞胚胎发生频率及稳定性，并且有效改善常规液体悬浮系建立过程中的褐化现象。在杉木体细胞胚胎发生时添加PSK可以启动低密度条件下的细胞分裂，维持胚柄细胞的稳定性，从而建立稳定增殖的液体悬浮细胞系。该研究解决了因杉木体胚发生体系不完善而引起的体胚发生频率低的问题，缩短了培养时间，节约了生产成本，为实现杉木产业化生产提供了有利条件。