根瘤菌引起的刺槐传递细胞中Myb类转录因子的克隆和功能分析开题报告

1. 研究目的与意义

本课题研究克隆根瘤菌引起的传递细胞中Myb类转录因子的基因，并对其进行相应的功能分析。Myb类转录因子是一类植物中广泛的调控蛋白，在细胞生长分化、抗逆等各种生理活动均活性体现。本课题前期构建了根瘤菌与刺槐互作后的根部组织和不接菌的刺槐根部组织的SSH差减文库，在库中发现，Myb类转录因子明显上调，因此，推测其在此类传递细胞中发挥了重要的调节作用。因此，本课题希望克隆出完整的Myb类转录因子的全长基因序列，并通过RNAi等方法来了解Myb类转录因子的功能，进而了解这类传递细胞的分化机制。

2. 国内外研究现状分析

根瘤菌侵染豆科植物后，在其根部形成独特的器官根瘤。根瘤中的根瘤菌(类菌体)利用宿主植物体提供的能量和内环境, 将空气中的n₂ 还原为氨,供宿主植物利用,形成了自然界效率最高的共生固氮作用. 在共生根瘤发育过程中, 根瘤菌与宿主植物之间发生了一系列复杂的信息交流。它涉及微生物与植物间专一性识别、信息交换和基因协调等复杂的生物学过程。因此，对根瘤菌与豆科植物互作的机理研究成为遗传学研究的热点之一。

近年来, 人们对共生固氮的研究取得了长足的进展, 特别是植物方面涉及共生结瘤的研究已经全面展开, 共生结瘤过程就是根瘤菌与宿主植物交换调节信号分子的相互作用过程。豆科植物种子或幼苗的根分泌出一种四羟基黄酮的多环化合物和甲氧苯基乙烯酮化合物（类黄酮物质），作用于根瘤菌的nodd 蛋白,活化的nodd 蛋白再激活其它nod（nodabc）基因表达并合成根瘤菌的应答信号结瘤因子,由根瘤菌分泌到环境中的结瘤因子有效刺激宿主植物,使根毛变形卷曲,根瘤菌再从该部位侵入并形成侵入线最终导致根瘤形成。该过程也称之为植物与根瘤菌的分子对话。研究表明,纯化的nod 因子可以引发根毛变形(had) 、皮层细胞分裂、有时甚至诱导根瘤发育。nod 因子的乙酰化残基的结构、还原端和非还原端的化学修饰以及几丁质寡糖骨架的长度都会影响nod 因子的活性（price np et al., 1995）。

传递细胞是植物在物质短途运输过程中出现的一类特化细胞，当植物某个部位的运输速率远高于溶质正常跨膜运输速率或受到环境状态的激发和信号的影响时，在此部位就可能有传递细胞的发生。（gunning and pate, 1974; offler et al., 2003; andriunas et al., 2013）传递细胞的典型特征是多层次的壁或细胞质膜的内突，在其附近，往往伴随着细胞质浓度的增加和细胞器结构的丰富，在延伸的壁内突附近多存在大量的线粒体和内膜分泌系统，这些都有助于溶质的共质体运输（gunning et al., 1968; davis et al., 1990）。一般来说，传递细胞会从一些已分化好的细胞类型中通过去分化、再分化和转分化后，发育成传递细胞（andriunas et al., 2013）,比如木质部、韧皮部的薄壁细胞，中柱鞘和表皮细胞等。由于其是来自于已分化的植物细胞，通常也被称为伴胞等（gunning et al., 1968; haritatos et al., 2000）。这种转分化过程发生在正常的植物组织发育过程中，也可能发生在一些生物或非生物的环境胁迫中。如向日葵的根表皮细胞在缺铁24~48 h内将会在其外周壁上形成壁内突(kramer 等1980)。甜菜的根表皮细胞在潜在性缺铁条件下也会分化为传递细胞( landsberg，1994)。某些微生物和动物侵入植物体后也可以诱导这些植物分化出传递细胞。如白避霜花被真菌侵染后, 与菌根真菌接触的根表皮和部分皮层细胞的外切向壁和径向壁上会产生壁内突(m. g. k. jones., 1972)。

3. 研究的基本内容与计划

1.基因序列的下载

2. 生物信息学分析及引物的设计

2.刺槐种子处理及固氮菌的培养

4. 研究创新点

刺槐是我国营造用材林、能源林的树种,又是豆科固氮树种。刺槐根瘤菌共生体所固定的氮,是刺槐树木生长所需氮的绝大部分。本实验前期发现根瘤菌诱导刺槐后不仅引起根毛形变，产生根瘤，根表层传递细胞还发生传递细胞的分化，这在木本科植物中为首次报导。本实验主要以根瘤菌作用刺槐后，刺槐根表层分化出的传递细胞中的mRNA反转录成的cRNA为模板，用引物扩增MRP-1的克隆条带，来确定刺槐中传递细胞的分化是否于该基因有关。实验数据主要来源于根瘤菌的培养、刺槐无菌苗的培养、对无菌苗组织的分离、提取分离的根毛（传递细胞存在的部位）组织中的mRNA，并反转录成cDNA,这中间涉及植物基因工程的一些研究手段和方法。