北美鹅掌楸AOX1基因克隆与生物信息学分析开题报告

1. 研究目的与意义

研究目的：

1、掌握基因克隆技术获得aox2基因；

2、对aox2基因进行功能预测及简单的生物信息学分析。

2. 国内外研究现状分析

植物线粒体呼吸链中除细胞色素途径外，还存在一条对氰化物不敏感的呼吸途径即抗氰呼吸途径。电子从泛醌库直接传递给交替氧化酶（alternative oxidase，aox），然后氧化生成水，放出热量。关于抗氰呼吸途径和aox基因的生物学功能一直是植物生理学领域中研究的热门课题，除在一些植物（如天南星科植物）开花过程中产热（有利于传粉）外，aox的其它生物学功能还未定论。抗氰交替呼吸途径是植物线粒体区别于动物线粒体的一个显著功能特征。现有的研究表明，抗氰交替途径在所研究过的植物中普遍存在，关于这条呼吸途径存在的生理意义及其运行的调节是近年来植物呼吸代谢领域研究的热门课题，特别是对其末端氧化酶的研究越来越受到人们的重视。早在1957年yocum等人就推测植物线粒体中存在一种抗氰的交替氧化酶，但由于该酶的一些光谱学参数不清楚，以及该酶的极度不稳定性等原因，其性质曾一直难于确定。到1986年bonner（1986）等人利用去氧胆酸钾和十二烷基麦芽糖苷首次把aox从斑叶阿若母（arum maculatum）线粒体中溶解下来，使之部分纯化，同时又保持抗氰而对水杨基氧肟酸敏感的催化活性。rhoads和mc intosh（1991）从乌杜百合（sauromatum guttatum schott）中获得aox的cdna克隆，并命名为aox1基因。所推测的引导肽在氨基酸组成及其它一些生化特征方面，与其它许多核基因编码的线粒体蛋白的引导肽相似。随着乌杜百合的aox1被成功克隆，其它一些植物的aox基因，如异常汉逊酵母（sakajo，1991）、拟南芥（kumar，1992；saisho，1997）、烟草（vanlerberghe，1994；whelan，1995）、马铃薯（vanlerberghe，1992）、水稻（ito，1997）、大豆（kearns，1992；finnegan，1997；whelan，1993）、芒果（cruz，1995）等也相继被筛选出来。

高等植物的aox是由核基因编码（elthon，1989）。以 sauromatum guttotum为材料己分离出第一个aox蛋白抗体（elthon，1989；rhoads，1991）。利用cdna文库筛选，pcr 扩增等方法，发现在许多非产热植物中，aox是由核内的一个小基因家族编码（considine，2002）。aox基因及其表达在近年来已得到详细的阐述(vanlerberghe，1997；simons，1999；mc donald，2002)。多种环境条件和发育过程都涉及aox的mrna、蛋白质和/或抗氰呼吸不同水平的变化。例如，病毒感染（simons，1999；maxwell，2002；ordog，2002）、冻害、冷胁迫(vanlerberghe，1992；purvis，1993)、磷亏损(parsons，1999；juszczuk，2001)、氧浓度变化(szal，2003)、植物开花(raskin，1987)、衰老(hisher，1990；maxwell，2002)和果实成熟（cruz，1995；consieline，2001）。

研究表明，aox基因的表达具有组织特异性，并且与植物的发育阶段相关。saisho等利用rt-rcr扩增技术，发现拟南芥中aox1a和aox1c在所有器官中都能表达，而aox1b只在花和芽中表达；aox2则主要在茎和根中具有转录活性（saisho，1997）。在大豆中进行的实验表明，三种aox基因的表达既具有组织特异性也与其生理状态相关（finnegan，1997）。mc cabe等人利用免疫印迹技术发现，大豆中编码32kd蛋白的aox2在5d龄的子叶中占主导地位，但随着子叶龄的增长，编码36kd蛋白的aox3的表达逐渐增强，在10d时其表达强度即接近于 aox2；到14d时，aox3己上升到主导地位，这说明aox基因家族成员在植物的不同发育阶段各自的表达程度不一致（mc cabe，1998）。

3. 研究的基本内容与计划

研究内容：

交替氧化酶（aox）是抗氰呼吸途径的末端氧化酶，aox广泛存在于高等植物中，研究表明其在植物生长发育的各个生理过程及植物对环境的适应过程中起到要作用，这与其自身结构有密切关系。植物交替氧化酶是由1个基因家族组成，该家族可以分为aox1和aox2基因家族。不同物种aox基因的数目和类型多样化，同一物种基因家族中不同的aox基因在植物中发挥的功能也不相同。目前，国内外对交替氧化酶基因研究取得了重大进展。迄今为止已成功的从许多植物，例如拟南芥、烟草、水稻、大豆中分离到交替氧化酶基因的cdna。研究者已经从很多植物中提取到aox基因并进行了结构功能等方面的分析。研究者预测交替氧化酶的功能有在植物开花过程中产热，维持植物细胞内ph稳定，维持代谢平衡，稳定泛醌库的还原状态，抑制活性氧的产生并且参与植物抗病信号转导途径。

研究方法:

4. 研究创新点

本次实验首次采用RACE技术在北美鹅掌楸中克隆出AOX2基因，为基因功能以及生物进化研究奠定基础。cDNA末端快速扩增技术（rapid amplification of cDNA ends，RACE）是一种基于PCR从低丰度的转录本中快速扩增cDNA的5'和3'末端的有效方法，以其简单、快速、廉价等优势而受到越来越多的重视。