鹅掌楸LcDHAR1基因的功能分析开题报告

1. 研究目的与意义

脱氢抗坏血酸还原酶（DHAR）在植物抗坏血酸-谷胱甘肽（AsA-GSH）循环中有关键作用，DHAR可以利用GSH作为还原剂将DHA还原为AsA，从而使AsA再生循环利用；而AsA可以有效清除逆境胁迫下植物体内产生的大量活性氧自由基（ROS），因而DHAR作为调控AsA氧化还原态的关键酶在植物抗氧化及AsA再生过程中具重要作用，研究表明DHAR的过量表达可以在一定程度上提高植物的抗逆性。鹅掌楸(Liriodendron chinense Sarg . )作为优良的园林观赏和用材树种，对其适应性机制开展深入的研究在推广应用上有重要的意义。目前，鹅掌楸属种间杂交育种及快繁技术研究取得了一定的进展，而关于该树种抗逆适应机制研究报道较少。

本课题以前期克隆的鹅掌楸DHAR1基因为基础，通过花絮侵染法转化拟南芥获得T₀代种子，筛选培养得到T₃代转基因种子用于低温、干旱、盐胁迫处理。探究转基因植株的在逆境条件下的生理生化反应以及适应性变化，从而验证鹅掌楸DHAR1基因功能，同时也为鹅掌楸适应性相关基因研究以及鹅掌楸抗逆育种奠定基础。

2. 国内外研究现状分析

由于DHAR基因在酶促机制中的抗氧化作用以及在抗坏血酸-谷胱甘肽循环中对抗坏血酸有重要的再生作用，使人们逐渐重视对于DHAR的研究。1952年，Yamaguchi等从豌豆中首次分离纯化出植物脱氢抗坏血酸还原酶；1984年，该酶又从菠菜中被分离出来，并被证实是一个单体酶，其结构中含有硫醇基，只以谷胱甘肽（GSH）作为电子供体，参与AsA的再生，将抗坏血酸氧化产物脱氢抗坏血酸（DHA）还原为AsA。Uranoa等人在2000年从水稻中首次克隆得到了脱氢抗坏血酸还原酶基因的全长，命名为DHAR1，并利用得到的EST序列分析DHAR可能广泛分布于各种植物中，此外也发现水稻中的DHAR比鼠中的具有更高的酶活而且可以在高温下诱导，因此研究人员推测它可能具有响应高温胁迫的功能。至此越来越多的人从植物发现DHAR基因并利用克隆得到基因进行生理功能等方面的研究。同年，Shimaoka等人在菠菜中发现了两种类型的DHAR而且知道其中的一种类型具有定位于叶绿体的信号肽。2006年，Zou等从番茄中分离得到了编码叶绿体和细胞质DHAR的cDNA，确定了两个基因分别位于番茄染色体图谱8号和2号染色体，发现细胞质DHAR在番茄各个器官中均有表达，而叶绿体DHAR仅在叶片中表达，定量的描述了抗坏血酸相关基因的表达。

Chen等研究表明，过量表达DHAR会使植物中AsA的积累量增加，并且提高AsA/DHA比率。DHAR过量表达能够维持保卫细胞的抗坏血酸循环的基本水平，增加气孔开张比例，而DHAR表达被抑制的转基因植株叶片保卫细胞张开比例显著降低。通过DHAR基因正义或反义转化烟草研究DHAR对植物生长发育的影响，结果发现由于在AsA-GSH循环中的重要功能，DHAR的过量表达能维持烟草叶片中1,5-二磷酸核酮糖羧化酶、捕光复合体（LHCII）以及叶绿体的稳定性，从而提高植物的生长速率并且抑制叶片的衰老^[29]。Eltayeb等将拟南芥DHAR基因转化烟草，发现其转基因植株AsA水平显著增加，且耐旱、耐盐及抗氧化能力明显增强。同样有学者将水稻DHAR基因导入拟南芥，发现虽然转基因植株AsA水平增加幅度较小，但耐盐性显著增加。

3. 研究的基本内容与计划

本课题以前期克隆的鹅掌楸lcdhar1基因为基础，通过花絮侵染法转化拟南芥，对t₃代转基因植株进行低温、干旱和盐处理，研究转基因植株的在逆境条件下的生理生化反应以及适应性变化，从而验证鹅掌楸lcdhar1基因功能，同时也为鹅掌楸适应性相关基因研究以及鹅掌楸抗逆育种奠定基础。主要研究内容如下：

（1）农杆菌花絮侵染法将鹅掌楸lcdhar1基因转化拟南芥；

（2）转基因植株筛选及分子鉴定；

4. 研究创新点

本研究对鹅掌楸LcDHAR1基因功能进行研究，构建鹅掌楸LcDHAR1基因超表达载体并转化拟南芥，对T₃代转基因植株进行低温、干旱、盐胁迫等处理来探索LcDHAR1基因在应对植物逆境胁迫中的作用，从而验证鹅掌楸LcDHAR1基因的相关功能，为鹅掌楸适应性相关基因研究以及鹅掌楸抗逆育种奠定一定的基础。