马尾松球果发育不同时期qRT-PCR内参基因的筛选与评价开题报告

1. 研究目的与意义

本试验中选取的9个候选内参基因均为传统的看家基因，利用 genorm、 normfinder 和 bestkeeper 综合评价其表达稳定性。并利用筛选得到的内参基因研究马尾松球果发育不同时期的基因表达，为今后的马尾松功能基因表达调控研究提供理论基础。

由于rna 的质量和完整性、模板 cdna 的质量和数量、引物的特异性和 pcr 扩增等因素，将影响qrt-pcr目标基因的定性定量表达分析，需要在特定试验条件对qrt-pcr中稳定表达的内参基因进行校正和标准化。

马尾松（学名：pinus massonianalamb.）遍布华中、华南各地，一般分布在海拔800 ～ 900 m以下。其球果不同发育时期的基因表达存在一定的差异，为分析表达差异的基因的真实性，选用qrt-pcr分子技术进行验证。筛选适合马尾松球果发育不同时期的内参基因，对研究其重要基因和蛋白表达具有重要意义。

2. 国内外研究现状分析

马尾松（学名：Pinus massonianaLamb.）遍布华中、华南各地，一般分布在海拔800 ～ 900 m以下。马尾松球果有两次明显的生长，马尾松球果不同部位的种子质量存在差异。

qRT-PCR技术具有高灵敏度、高特异性和重复性好等优点，已经被广泛用于生物科学的各个研究领域。在利用qRT-PCR技术中，必须选择适宜的内参基因进行校正和标准化。目前，常用的内参基因有肌动蛋白基因(ACT)、α/β微管蛋白基因(TUA/TUB)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(GAPDH)、转录延伸因子基因(EF1α)等。实时荧光定量PCR技术中荧光标记方法可分为扩增序列非特异和扩增序列特异两类检测，现在主要采用的是扩增序列特异性检测方法。对于实验结果的处理与分析主要分为四步：RNA提取及质量检测；引物扩增特异性和扩增效率分析；候选内参基因表达丰度分析；内参基因稳定性分析。常用内参稳定性分析软件 ge Norm、Norm Finder、SPSS20.0和Best Keeper来分析候选内参基因。

3. 研究的基本内容与计划

一、内容

本研究以马尾松球果为材料，对总rna进行提取和cdna第1链合成，利用qrt-pcr技术对9个候选内参基因的表达量进行分析并进行qrt-pcr 引物的设计。该技术具有高灵敏度、高特异性和重复性好等优点。然后,使用genorm、normfinder 和bestkeeper等对马尾松球果发育不同时期表达稳定性进行综合评价。通过以上分析, 以期在马尾松球果中筛选出适用于不同时期的内参基因。

二、计划

4. 研究创新点

马尾松球果不同发育时期的基因表达存在一定的差异，为分析表达差异的基因的真实性，选用发展成熟且应用广泛的qRT-PCR分子技术进行验证，筛选适合马尾松球果发育不同时期的内参基因。