1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
生防假单胞菌（pseudomonas spp.）是植物根围促生细菌（plant growth promoting rhizobacteria, pgpr）研究领域的典型代表。这类细菌具有高效利用种子和根系渗出物，快速生长繁殖，有效定殖在植物根际，产生多类活性代谢物质等优点[1]。部分菌株已经商业化应用于植物病害生物防治，如假单胞菌esc-10和a506等[2]。国内的铜绿假单胞菌m18和荧光假单胞菌2p24等也具有很好的生防效果[3-4]。此外，部分假单胞菌抗菌物质已在农药杀菌剂领域得到商业化的应用，如硝吡咯菌素（pyrrolnitrin，prn）衍生出的拌种咯和咯菌腈[5]；我国自主研发的申嗪霉素，其主要成份吩嗪-1-羧酸（phenazine-1-carboxylicacid，pca）产自m18菌株[3]。而开发此类微生物杀菌剂的关键是充分了解活性物质合成调控以及作用机理等，相关的研究工作能为这类制剂的研制与应用提供重要理论基础。
假单胞菌p. protegens pf-5菌株，先前命名为荧光假单胞菌（p. fluorescens ）pf-5。该菌株分离自棉花根际土壤，对卵菌、真菌和细菌等引起的植物病害具有较好的防治效果。pf-5菌株全基因组已知，能遗传操作，是研究生防假单胞菌的模式菌株[6]。pf-5菌株能通过非核糖体途径合成多种活性物质，这些物质在其防治植物病害中起着重要作用。如2,4-二乙酰基间苯三酚（2,4-diacetylphloroglucinol,dapg）具有抑制细菌、真菌和卵菌活性[6]，还能作为激发子诱导植物产生系统抗性（induced systemicresistance，isr)[7]；硝吡咯菌素对菌核病菌和丝核病菌具有较强的抑制活性[8]；藤黄绿脓菌素（pyoluteorin, plt）具有抑制卵菌和细菌的活性[9]；新鉴定的根菌素（rhizoxin）和脂肽类物质（orfamidea）也具有抑制真菌的活性[10-11]；挥发性抑菌物质氢氰酸（hydrogen cyanide, hcn），有助于防治土传病害[6]。另外，pf-5菌株能产生两种嗜铁素pyochelin和pyoverdine，这类物质能帮助其竞争铁元素抑制病原物生长[6]；还含有杀螟虫幼虫活性相关基因簇fit[12]。pf-5菌株利用复杂信号网络调控这些物质的合成。
对pf-5菌株的全基因组生物信息学分析表明，该菌株的ofa 操纵子中含有一个未知功能的luxr（pfl2143）转录调控因子。ofa操纵子还含有三个核心基因，分别是ofaa、ofab和ofac，编码三个非核糖体肽合成酶，组成多酶复合体，通过羟基硫代模板机制，合成脂肽orfamide a。orfamide a是一种表面活性剂，是该菌群集运动所必须的。orfamide a还具有抑菌活性。在操纵子中含有这类转录调控因子，通常具有调控该操纵子转录的活性。在本研究中，我们将研究luxr（pfl2143）能否调控ofa 操纵子转录，从而调控脂肽orfamide a的合成。我们还将研究相应的调控机理。
2. 研究的基本内容和问题
对于假单胞菌属另外一类重要生防菌p. protegens，目前尚未鉴定出相应的群体感应系统。pf-5菌株是p. protegens类生防菌的典型代表，也是研究生防假单胞菌的模式菌株[9]。该菌株具有较强的植物根际定殖能力和抑菌活性，全基因组已知，不含有Ⅲ型分泌系统，能遗传操作。该菌株能通过非核糖体途径合成多种抑菌活性物质，这些活性物质在其防治植物病害中发挥着重要作用。群体感应系统作为生防菌调控群集运动、定殖能力和抗菌物质合成的重要组成部分，在该菌株中尚未报道。因此，以pf-5菌株为具体操作对象，研究其群体感应系统，有助于从p. protegens类生防菌中发掘新的信号分子，揭示其调控群集运动和物质合成的机理。
分析表明luxr基因正好位于脂肽orfamide a合成操纵子内，推测可能调控这类物质的合成。基于实验和分析结果，推测生防菌p. protegens利用环二肽合成酶生成的cel作为群体感应信号分子，在与luxp/luxq组成群体感应系统后，调控下游因子luxu和luxo的磷酸化水平，进而影响转录因子luxr的表达，luxr能调控orfamide a的合成，从而影响生防菌p. protegens的群集运动。为此，我们开展了相关的研究工作。本研究将以pf-5菌株中转录因子luxr为研究对象，探究其调控生防假单胞菌pf-5菌株脂肽orfamide a合成的机理，为生防假单胞菌生物农药的应用提供理论支撑。
3. 研究的方法与方案
研究方法与实验方案
1、 p. protegens菌株luxr调控群集运动作用研究
luxr突变体以及回补体的构建：将luxr克隆到pk18mobsacb载体上，验证正确后，利用三亲交配将突变载体转入野生型 pf -5菌株中，融合片段与目的基因之间发生同源交换，涂布在含有相应抗生素的 kb平板上进行筛选，具有抗性的转化子则是进行了单交换子，同时利用 pcr验证，将将正确的单交换子 再接种于不含抗生素的 kb 培养基中培养 ，取 100ul 后涂布于含 10 ％蔗糖的 kb 培养基上进行生长，由于载体上的sacb基因在含有蔗糖的培养上具自杀能力，促进同源臂片段与目之间发生第二次同源重组，最后设计外围引物 （luxr out-f和luxr out-r）进行 pcr验证， 如扩增片段比原来短，证明敲除成功 。
4. 研究创新点
假单胞菌属中另外一类重要生防菌p. protegens，目前尚未鉴定出相应的群体感应系统。
而pf-5菌株是p. protegens类生防菌的典型代表，也是研究生防假单胞菌的模式菌株，群体感应系统作为生防菌调控群集运动、定殖能力和抗菌物质合成的重要组成部分，在该菌株中也尚未报道。
因此，以pf-5菌株为具体操作对象，研究其群体感应系统，有助于从p. protegens类生防菌中发掘新的信号分子，揭示其调控群集运动和物质合成的机理。
5. 研究计划与进展
2018年6月-8月 研究 p.protegens菌株luxr调控群集运动的作用。
2018年9月-10月 对luxr上游信号基因相关突变体、回补体等脂肽化合物含量的检测。
2018年11月-12月 p. protegens菌株调控转录调控因子luxr表达的研究。
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