1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
1.1课题意义
福寿螺(pomacea spp.)是危害生物多样性、农业生产和人类健康的世界性恶性入侵水生动物，其适应各种恶劣的环境条件，繁殖能力强，入侵扩散速度快[1]。福寿螺主要为害水稻、茭白、莲藕、芡实等水生作物，其食量大，可造成水生作物严重减产[2]。而且，福寿螺是广州管圆线虫（angiostrongylus cantonensis）的重要中间宿主，生食或半生食此类中间宿主，可导致其幼虫寄生于人体，造成人体的广州管圆线虫感染，引起嗜酸性粒细胞增多性脑膜脑炎或脑膜炎[3]。2001年福寿螺作为水产项目引进苏州，2004年弃养逃逸[4]后逐渐扩散到江苏苏南大部分地区。然而，福寿螺种群在苏南地区的入侵分布现状迄今依旧缺乏相关资料。
环境dna（environmental dna，edna）是近年来新出现的一种生物调查方法。edna技术在确定目标生物的特异性基因识别片段的基础上，从环境样品（如水和土壤）中直接提取的生物dna片段总和（例如生物体释放到环境中的胞内dna，或者细胞死亡后裂解释放到环境中的胞外dna）[5]，利用各种分子手段检测从环境介质中提取edna，识别目标生物dna片段，进而确定取样环境中目标生物的基因片段分布特征。与传统方法相比，edna技术具有灵敏度高、省时省力、对调查对象无损伤等优点，不要求调查者具有传统的生物识别及鉴定经验[6][7]。
2. 研究的基本内容和问题
2.1研究目标
以江苏苏南地区（苏州、无锡、昆山）河流和湖泊研究水体，以福寿螺(pomacea spp．)为研究对象，运用环境dna技术（edna）监测福寿螺种群的入侵空间分布特征。研究结果以期为江苏省有害入侵生物多样性调查和防控提供数据积累，为江苏省水环境管理提供数据支撑。
3. 研究的方法与方案
3.1研究方法和方案
3.1.1样点设计：利用Google卫星地图选取苏州、无锡、昆山内的河流和湖泊进行调查，标记每个采样点，根据栖息地自然属性和人类干扰特征，通过室内选点和现场调查相结合的方法确定监测和调查的点位，将调查区域划分为相同面积的小网格，在小网格里挑选出通湖的河流，结合之前该地区的底栖动物采样结果其中的福寿螺成体的相关资料，在河流选择便于采集的共40个合适点位，并将实地调查时的GPS(Garmin，eTrex 20)位点信息导入Arc GIS10.1中形成采样点分布图；3.1.2 水环境样品的采集：用全新2 L可密封广口瓶于采样点沿岸采集 ，在每个采样点每隔五米采一次样，一共采三次共1.5L，现场组装过滤器，利用手动真空泵和0.7μm滤膜现场过滤，过滤后用干净的镊子将滤膜置入无水乙醇保存，暂时放入-4℃冰箱保存，带回实验室后放入-20℃冰箱保存。
3.1.3 eDNA提取和分析：
（1）eDNA提取：用无菌剪刀剪碎滤膜，利用上海生工Ezup（Ezup Column Animal Genomic DNA Purification Kit）柱式动物基因组DNA抽提试剂盒从滤膜中提取DNA。
(2)PCR扩增：使用mlCOlintF/jgHCO219引物扩增每个样品，每个样品3次PCR重复。
本实验中扩增采用50μlPCR反应体系，配置如下表：
表1 2组引物50μlPCR反应体系
| 引物组 | MIX | 上游引物 | 下游引物 | DNA模板 |
| mlCOlintF/jgHCO219 | 44μl | 2μl | 2μl | 2μl |
表2 mlCOlintF/jgHCO219引物组详细信息
| 引物名称 | 方向 | 引物序列（5→3） | 扩增长度 |
| mlCOlintF | Fward | GGWACWGGWTGAACWGTWTAYCCYCC | 313bp |
| jgHCO2198 | Reverse | TANACYTCNGGRTGNCCRAARAAYCA |
(3)电泳检测：用2琼脂糖凝胶电泳进行对每个PCR产物进行检测。
(4)混样：将每个样本的3个PCR产物充分混合，使用Qubit2.0检测每个样品的浓度，等比例混合样本。
(5)文库构建、高通量测序：将混合后样本的送至北京诺禾致源生物信息科技有限公司进行文库构建，在Illumina Hiseq2500平台上使用250bp PE进行高通量测序。
（6）生物信息学分析：在VMware虚拟器下使用Linux操作系统，根据已编写好的程序进行下面的操作：合并双端序列、根据标签分流样本、质量控制(过滤低质量的序列)、序列修订(修整/删除不明确的序列)、将序列聚类成OTU并去除嵌合体和单倍体、从OTU中获取代表性序列、根据整理过的软体动物数据库对OTU进行鉴定，从而确定不同采样点位福寿螺的存在和种属。
3.1.4基于eDNA的江苏苏南福寿螺种群分布：依据eDNA结果，绘制入侵分布现状图，描述江苏苏南福寿螺入侵空间分布特征。
3.2技术路线
3.3可行性分析
本研究建立在水生态学的基础上，项目申请人前期已对项目实施的方案和技术路线进行了充分的文献调研，学习和掌握了基本的水生生物采样和鉴别技能以及生物统计方法。本研究需要实地调查采样，运用eDNA技术监测福寿螺的入侵状况。本实验室具备齐全的实验设备和良好的实验条件，以实验数据为依据，相关鉴定资料和文献为理论支撑，指导老师具有非常丰富的研究相关领域的经验，因此本研究具有很强的可行性。
4. 研究创新点
运用eDNA技术探索江苏南部地区入侵生物福寿螺的入侵现状和分布情况。
5. 研究计划与进展
2018年6月——2018年11月：查阅相关文献，了解研究背景，掌握基础知识，确定实验方案；
2018年11月——2018年12月：前往江苏南部地区福寿螺发生地进行实地考察和采样；
2019年1月——2018年2月：实验室提取edna；
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