小麦凝集素TaJRL53的白粉病抗性功能分析开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

1.研究意义1.1白粉病对小麦的危害小麦白粉病是一种世界性病害，在各主要产麦国均有分布，我国山东沿海、四川、贵州、云南发生普遍，为害严重。

近年来该病在东北、华北、西北麦区，亦有日趋严重之势。

该发病时，叶面出现12mm的白色霉点，后逐渐扩大为近圆形至椭圆形白色霉斑，霉斑表面有一层白粉，遇有外力或振动立即飞散。

2. 研究的基本内容和问题

（1）研究目标a．了解植物凝集素在植物抗病抗逆方面的重要作用，初步分析jrl基因家族在抗白粉病方面的基本作用。

b．学习掌握vigs、rt-pcr和qrt-pcr的基本原理和操作技术，学会应用其进行植物基因功能的检测。

c．学习掌握实验室工作的流程和基本实验技能，提高对实验工作信息的收集、整理、统计与交流等方面的能力。

3. 研究的方法与方案

（1）研究方法本实验拟利用bsmv作为vigs载体，将jrl中特异性表达的tajrl30和tajrl49的一段cdna片段插入bsmv-y载体的多克隆位点上，体外转录bsmv-vigs载体的3个组分，转染小麦叶片，实施bsmv诱导的tajrl基因沉默，随后接种白粉病病菌，进行抗白粉病鉴定，以快速分析小麦tajrl基因的抗病功能。

（2）技术路线（见附件）（3）实验方案i cdna的合成小麦总rna的提取。

a.取小于0.2g的材料液氮研磨成粉末状后移入1.5ml小指管;b.立即加1mltrizolreagent,轻弹管底,尽快混合样品至重悬;c.水平放置小指管室温孵育20min;d.4℃,12000rpm,离心10min;e.移澄清上清液入一新的1.5ml小指管中,加入0.2ml氯仿,盖紧管盖,用力摇动1.5ml小指管15s,室温孵育2min-3min;f.4℃,12000rpm,离心15min;g.移最上层水相到新的1.5ml小指管中,加入0.25ml异丙醇、0.25ml高盐混合液(0.8mol/l柠檬酸钠 1.2mol/lnacl)混匀,室温孵育30min;h.14℃,12000rpm,离心10min;i.弃上清,用1ml75%乙醇(用depc水来配)洗沉淀,涡旋混合样品,4℃,12000rpm离心5min;j.弃上清,短暂干燥,rna沉淀5min-10min,用rnase-free(depc处理过的)水溶解沉淀,-70℃保存,供以下实验使用。

4. 研究创新点

（1）传统的基因功能分析的研究方法存在一定的局限，比如研究周期长、需要遗传转化且转化效率低，从而限制了这些方法快速高效的应用于植物基因功能的研究，而本实验应用的vigs是一种转录后基因沉默现象，较传统的研究方法更加快速、高效。

（2）目前尚未有过利用vigs技术系统地研究小麦jrl基因家族功能的报道，而小麦jrl基因达67个之多，目前已用vigs技术分析出抗性的基因仅仅只有2个。

因此，本实验项目对vigs技术和jrl基因家族的研究具有十分重要的理论意义和实际价值。

5. 研究计划与进展

1.完成bsmv-γ：tajrl53载体的构建a.酶切tajrl基因片段和bsmv-载体b.连接tajrl基因片段和bsmv-载体c.转化bsmv-γ：tajrl53载体进入大肠杆菌d.培养大肠杆菌，并涂板挑菌e.培养阳性菌f.提质粒g.酶切验证2.体外转录，病毒涂抹，接菌感染。

a.酶切bsmv-γ：tajrl53载体并验证b.抽提dnac.定量并稀释d.体外转录e.配置α :β :γ/γ-jrl53 :fes buffer=1:1:1:22.5f.实验材料培养至一心一叶期,涂抹病毒病毒涂抹一周后未出现表型，病毒涂抹失败，现已完成第二次体外转录及病毒涂抹。

完善不足，重复试验。