油菜细胞质PCR鉴定方法初步研究开题报告

1. 研究目的与意义

1.本课题的意义

细胞质雄性不育广泛地应用于油菜杂种优势利用，油菜细胞质类型的鉴定是油菜杂交育种的重要基础工作。而当前主要的鉴定油菜细胞质的方法有：对油菜基因组进行测序或提取油菜线粒体，对线粒体基因组进行测序，然后通过对各个细胞质类型的特异性片段进行对比^[1]或酶切后通过琼脂糖凝胶电泳分离,进行southern blot和探针标记从而确定油菜细胞质的类型^[2]。上述方法鉴定花费时间长且工作量大，难以适应需要大量进行的实验的需求，而本实验拟探究一种新型的对油菜细胞质类型进行鉴定的方法，旨在通过简化对油菜进行细胞质类型鉴定的环节从而节约实验成本，提高实验效率，为将来的油菜遗传育种研究工作提供新方法。

2.国内外研究概况

2. 研究内容和预期目标

1.研究的目标

本实验旨在通过pcr技术，探究一种高效便捷地对油菜细胞质类型进行鉴定的方法，从而简化油菜遗传育种研究的工作环节，降低实验成本，为油菜研究工作提供新思路、新方法。

2．研究的内容

3. 研究的方法与步骤

1.研究方法

本实验拟通过PCR鉴定方法，探究一种高效便捷的鉴定油菜细胞质类型的方法，具体来说，本实验通过对目标材料全基因组DNA进行提取后通过引物设计，对模板材料进行PCR扩增，同时对已知细胞质类型材料线粒体进行提取，并提取其中的mtDNA，后将两种材料的进行琼脂糖凝胶电泳检测，将检测结果进行对比、分析，确定本实验所采取的PCR鉴定方法能否准确有效的鉴定油菜细胞质类型。

2.技术路线

如附件一所示。

3.实验方案

3.1 实验材料

本实验植物材料取自南京农业大学江浦农场，具体材料名称如下表所示：

表1：实验材料名称

3.2 油菜基因组DNA的提取

3.2.1 取植物新鲜叶片0.3-0.4g与液氮中研磨完全，装入2ml Eppendorf管中。

3.2.2 加入1.5ml的2CTAB溶液和40μl β-巯基乙醇，充分振荡混匀。65℃水浴45-60分钟，每隔5分钟振荡混匀一次。

3.2.3 4℃，10000rpm离心5分钟，取上清液，加入等体积酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），轻柔混匀（10分钟左右），4℃，8000rpm离心5分钟，取上清液，再加入等体积酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）重复抽提至上清液清澈取上清至新的1.5ml Eppendorf管。

3.2.4 加入0.6倍体积预冷的异丙醇和0.1倍体积3M的乙酸钠（pH 5.2），充分混匀，-20℃沉淀1小时，4℃，8000rpm离心20分钟，弃上清。

3.2.5 加入1ml的70%乙醇洗涤沉淀两次。经无菌风干燥后溶于150μl TE溶液中，电泳检测，

3.2.6 将DNA样品稀释至200μl，加入1μl RNase后37℃酶解1小时，加入等体积酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），轻柔混匀，然后4℃，12000rpm离心5分钟，取上清至新管，再用等体积酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）重复抽提至上清液清澈，将上清转移到新管。

3.2.7 加入0.1倍体积3M的乙酸钠（pH 5.2）和2倍体积-20℃预冷的无水乙醇沉淀洗涤，-20静置1小时，4℃，8000rpm离心20分钟，弃上清。

3.2.8 加入1ml的70%乙醇洗涤沉淀两次，经无菌风干燥后溶于50μl TE溶液中。电泳检测。同时用酶标仪检测样品的A260:A280及DNA浓度。合成的DNA可直接作为PCR反应的模板使用，或者-20℃保存。

3.3 油菜线粒体的提取

以下操作除特殊说明外,均在4℃或者冰上进行。

3.3.1 粗制线粒体的提取

本实验采用差速离心和蔗糖衬垫相结合的方法粗提线粒体。先取黄化苗用剪刀剪碎,然后用预冷的玻璃匀浆器将其彻底研磨。将研磨好的样品,用4层100目的尼龙网过滤之后,将收集的滤液进行多次不同目的离心,得到粗制线粒体。将滤液15000rpm离心15min,取上清,再15000rpm离心15min,收集沉淀。在上述沉淀中按每5g鲜重加入1ml悬浮缓冲液,用毛笔轻轻悬浮沉淀。悬浮液3000g, 15000rpm离心10min,取上清。

上述上清液按照每克鲜重加入2.5μg DNaseⅠ,在室温酶切反应,每隔5min轻轻摇动悬浮液,30min后转入4℃酶切1h,去除线粒体之外的其它DNA。经DNaseⅠ消化后,向悬浮液中加入预冷的EDTA至终浓度50mmol/L,以终止DNaseⅠ酶切反应。加少许洗涤缓冲液,用毛笔轻轻悬浮沉淀,补加洗涤液1ml/5g,15000rpm离心20min,收集沉淀即为粗制线粒体。

3.3.2 蔗糖密度梯度离心法纯化线粒体

通过蔗糖铺垫法得到粗制线粒体,然后利用蔗糖密度梯度离心将粗制线粒体进一步纯化。虽然很多研究表明CsCl密度梯度离心能够提取高度纯化的mtNDA。但是氯化艳价格很贵,操作复杂、费时。所以本研究采用了价格低廉且容易制备的蔗糖密度梯度法纯化线粒体。利用蔗糖密度梯度法,只要把条件控制严格,同样可以分离得到高纯度线粒体。前人做蔗糖铺层时,一般采用1.2M和1.6M这两个密度,而线粒体密度与1.36M蔗糖溶液的密度接近。所以本文将蔗糖密度范围进一步缩小,采用了1.2M和1.45M这两个密度梯度,该条件下比线粒体密度大的其他杂质（包括残碎细胞器碎片和完整的细胞核等）更容易借助于离心力的作用沉落到离心管的底部而与线粒体分离,使线粒体纯度更高。将粗制线粒体小心加在事先铺好的蔗糖密度梯度的离心管顶端,经过水平转72000g、90min的超速离心,可将线粒体与质体、破碎的细胞核及细胞器残片精确分离。

3.4 油菜线粒体DNA的提取

3.4.1 主要试剂的配置

研磨缓冲液A（pH 7.5）：称取205.2g蔗糖溶于1L去离子水中,加入60ml 1M Tris-HCl、12ml 0.5M EDTA、1.2g BSA、438μl β-琉基乙醇及18g PVP,混合均匀后,定容至1.2L；悬浮缓冲液液B（pH 7.5）：称取17.1蔗糖溶于80ml去离子水中,加入5ml 1M Tris-HCl、0.61MgCl₂定容至100ml；洗涤缓冲液C（pH 7.0）：称取20.5蔗糖溶于80ml去离子水中,加入1ml 1M Tris-HCl、4ml 0.5M EDTA,定容至100ml,调节pH值至7.0；

3.4.2 线粒体的纯化

2.5mg/ml DNaseⅠ：25ml DNaseⅠ加入10ml无菌水,轻柔混匀,分装后-20℃贮存（可保存9个月）,每次按需取出；1.2M蔗糖：称取82.12g蔗糖,加入2ml 1M Tris-HCl, 8ml 0.5M EDTA,调节pH至7.2,定容至200ml；1.45M蔗糖：称取99.24蔗糖,加入2ml 1M Tris-HCl, 8ml 0.5M EDTA,调节pH至7.2,定容至200ml；

3.4.3 线粒体的裂解及DNA的提取

裂解缓冲液（pH 8.0）：在80ml去离子水中加入5ml 1M Tris-HCl和0.2ml 0.5M EDTA,定容至100ml；1mg/ml蛋白酶K：将100mg蛋白酶K加入9.5ml去离子水中,轻轻摇动,直至蛋白酶K完全溶解,不要涡旋混合。加水定容至10ml,此为10mg/ml的蛋白酶K工作液；5mg/mlRNase A（DNase-free）：将10ml RNase A溶解在1ml 10mM醋酸钠缓冲液中（pH 5.0）,溶解后沸水煮15min,使DNA酶失活,用0.1体积的1M Tris-HCl（pH 8.0）调整pH至7.5,于-20℃贮存；

3.5 油菜特异性片段的PCR扩增

以mtDNA作为模板，进行PCR扩增，提取PCR扩增产物进行检测，引物序列如下附件二所示。

PCR扩增反应体系：反应总体积为25μl,依次加入10Tap buffer 2.5μl、2.5mM dNTP 0.5μl、上下游引物（10μM）各0.5μl、mtDNA模板1μl,Tap polymerase 0.5μl,最后加ddH2O补足至25μl,混匀,并短暂离心,放入热循环仪上进行PCR反应。热循环程序：95℃预变性5min,95℃变性40s,然后51-57℃退火45s,最后72℃延伸,共个32循环,待反应完成后再72℃延伸10min,最后4℃保存。取10μlPCR反应产物在1%琼脂糖凝胶中电泳检测。

4.可行性分析

本实验拟探究一种高效便捷的鉴定油菜细胞质类型的方法，从国内外先前的研究来看，过去的研究多采用对油菜基因组进行测序或提取油菜线粒体，对线粒体基因组进行测序，然后通过对各个细胞质类型的特异性片段进行对比或通过以线粒体基因片段为探针,进行线粒体DNA RFLP分析从而确定油菜细胞质的类型，但是此类方法实验过程复杂，耗时长，极大的影响油菜遗传育种工作的工作进程，而当前国内外有少有科研工作者来探究一种新型的，高效的，便捷的鉴定油菜细胞质类型的方法来简化实验环节，因此本实验采取对油菜全DNA（核DNA与线粒体DNA）一并进行提取，然后通过已知的各个细胞质类型的特异性片段进行引物设计，再通过PCR技术对目标材料进行扩增，然后对PCR扩增产物进行鉴定，从而确定油菜细胞质的类型，本实验方案完善，实验方法切实可行，从实验条件来看，南京农业大学油菜课题组有长期的科学研究经验，实验条件完善，完全具备完成本实验所需的全部实验仪器及材料，同时本课题组在管荣展教授的带领下硕果累累，在油菜遗传育种领域多有建树，在拥有丰富科研经验的管荣展老师的带领下以及师兄师姐的指导下，本实验一定能够顺利进行。综上所述本实验设计具有详尽可行的实验方案，完备优良的实验条件，学术水平精湛、对待学生亲切负责的老师，因此本实验方案切实可行。

4. 参考文献

细胞质雄性不育广泛地应用于油菜杂种优势利用，油菜细胞质类型的鉴定是油菜杂交育种的重要基础工作。本实验通过简便易行的PCR鉴定方法，对油菜全基因组DNA进行提取后通过引物设计，进行特异性片段PCR扩增，通过扩增产物鉴定油菜细胞质类型。近些年来，探究新型鉴别油菜细胞质类型方法的研究鲜见报道，因而本实验拟探究一种简便高效地鉴定油菜细胞质类型的方法，希望可以简化实验环节，提高实验效率。

5. 计划与进度安排

本实验在2022年7月2022年6月间进行，研究计划及预期进展如下：

1.2022年7月2022年11月

阅读相关文献，完善并确定实验方案，学习相关实验操作方法，学习相关仪器的使用方法以及相关试剂的配制，进行本实验的相关材料、仪器、设施的准备工作。