大豆疫霉根腐病抗性候选基因Glyma.03g035300的表达分析及克隆开题报告

1. 研究目的与意义

一、课题意义

大豆疫霉根腐病（phytophthora root rot of soybean, prr）是由土传卵菌大豆疫霉（phytophthora sojae kaufmann gerdemann, p. sojae）引起的在大豆生产上的最严重的病害之一。该病于1948年在美国印第安纳州首次发现，目前发生范围囊括了美洲、欧洲、大洋洲、亚洲的大豆主产区，已成为世界性的大豆病害。在1989年我国首次在东北大豆产区分离到大豆疫霉，证实了该菌在我国的存在^[1]。据报道，近10年该病在我国传播范围逐渐扩大^[2]，给我国大豆生产带来了严重的威胁。培育和种植抗病品种是防治该病害最经济、有效、安全的方法，而抗病育种的关键是具备优异抗源，并阐明大豆对大豆疫霉根腐病的抗性遗传规律。利用实时荧光定量pcr（quantitative real-time polymerase chain reaction, qrt-pcr）技术对抗性基因目标区段内的候选基因进行定量表达分析研究，进一步确定抗性品种抗病的关键基因，以阐明其抗病的分子机制，为大豆抗性基因的图位克隆奠定基础。到目前为止已经定位到了一些与疫霉根腐病抗性相关的基因，但抗性基因的图位克隆报道很少。据报道，蛋白激酶在抗病信号传递中能起到很重要的作用^[3]，所以本研究在利用蒙8026和临蒙6-46衍生的f2:3家系精细定位的基础上，在其候选区域内找到了一个丝氨酸／组氨酸蛋白激酶，利用qrt-pcr技术比较了大豆抗病品种蒙8206和感病品种临蒙6-46接种疫霉菌株hen08-35在不同时间转录水平上的差异，目的在于确定该基因是否受疫霉诱导。利用willimas82的转录序列，设计引物克隆其cds序列，为最终克隆抗性基因和研究功能奠定基础。

二、国内外研究现状

2. 研究内容和预期目标

1、研究目标

大豆疫霉根腐病严重影响大豆的产量和品质，通过寻找新的抗病基因，可以安全有效的防治该病的发生。目前已经鉴定出了一些完全抗性基因，但是有关这些基因的图位克隆的报道还很少。通过对候选基因进行qrt-pcr分析，明确该基因是否受疫霉诱导，确定大豆疫霉根腐病抗性相关基因。并对其cds序列进行克隆，为最终克隆抗性基因和研究功能奠定基础。

2、研究内容

3. 研究的方法与步骤

4、技术路线

荧光定量引物设计→候选基因qRT-PCR分析→克隆基因引物设计→对候选基因进行cds序列图位克隆

5、研究方法及实验方案

5.1接种和取样方法

在温室种植大豆抗病品种蒙8206和感病品种临蒙6-46，在种植7天后在下胚轴接种疫霉菌株HeN08-35，以V8培养基做为空白对照。分别在接种后0、12、36、48h和72h取样后液氮速冻,在-80C冰筘中保存以备进行qRT-PCR分析。

5.2候选基因的筛选

在精细定位的基础上，根据已经公布的大豆品种Williams82数据库的信息(http://www.phytozome.net/soybean),根据基因注释，从中找出可能的抗病基因。

5.3总RNA的提取

利用 TIANGEN RNA simple Total RNA Kit 提取植物总 RNA (表 1-1 ),研钵,

研棒等放于小托盘中用无水酒精烧30 min。

表1-1 RNA提取试剂盒内容

Table 1-1 The constitution of Kit for RNA extraction RNase-free

提取方法参考试剂盒步骤说明:

①匀浆处理:将组织在液氮中迅速磨碎,每50~100mg组织加入1mlTRIzol,用匀架仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10%。

②将匀浆样品在室温(25~30℃）放置5min,使核酸蛋白复合物完全分离。

③可选步骤:如样品中含有较多蛋白质、脂肪、多糖或胞外物质(肌肉、植物结节部分等)可于4℃,10000rpm离心10min,取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜、多糖和

高分子量DNA,上清中含有RNA。处理脂肪组织时,上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。

④每使用1ml TRIzol加入200μl氯仿,盖紧管盖,用手上下剧烈振荡15 s (勿涡旋),

得粉红色浑浊液,无分层现象,室温放置3min。

⑤4℃,12000rpm离心15min。样品分为三层:底层为黄色有机相,上层为无色水相和一个中间层。RNA主耍在水相中,水相体积约为所用TRIzol试剂的60%；把水相转移到新管中,进行下一步操作。

⑥向得到的上清水相中加入等体积的异丙醇,混匀,室温放置10min；室温12000rpm

离心lOmin,小心去上清,不要打动沉淀。

⑦加入1ml75%的乙醇(用DEPC处理过的水配制),轻弹管底,静置5min, 12000rpm离心5min;去上清。

⑧RNA沉淀置无菌风下吹干;加入适量的DEPC水溶解,立即于-70℃超低温冰箱中保存备用。

⑨总RNA的完整性检测:用1.0%普通琼脂糖凝胶分离总RNA,如果出现两条清晰的条带,且最大的两条条带(28SRNA: 18SRNA)的亮度比约为2: 1,而5SRNA可见,则说明RNA没有被降解。

5.4 cDNA第一链的合成

cDNA第一链的合成及扩增依据TaKaRa试剂公司cDNA第一链合成及扩增试剂盒 TaKaRa RNA PCR Kit (Avian Myeloblastosis Virus, AMV) Ver.3.0 (DRR019A),具体操作见说明:

①按下列组成配制反转录反应液:

Mg² 4 l

lORT Buffer 2 l

RNase Free ddH₂O 5.5 l

dNTP 2 l

RNase Inhibitor 0.5 l

RPPReverse Transcriptase 1 l

Oligo dT-Adaptor Primer 1 l

RNA 4 l

Total 20 l

②按下列条件进行反转录反应（前三步1Cycle）:

30℃ 10 min

42℃ 30 min

72℃ 5 min

4℃ forever

5.5 qRT-PCR 分析

根据抗性莲因的标记定位和S标区段基因预测的结果,选择一些可能与抗病相关的候选基因进行qRT-PCR,并以大豆组成型表达的ACTIN基因为内部参照,设计内参引物。qRT-PCR的引物是根据预测基因的序列,用Primer 5.0进行特异引物设计,使用TaKaRa的SYBR Premix Ex TaqTM PGR试剂总,按照说明操作，具体反应体系和扩增条件见表1-2。

表1-2 qRT-PCR反应体系和扩增条件

Table 1-2 The assay condition and qRT-PCR progra

反应体系PGR扩增条

Reaction systemPCR amplification condition

SYBRMIX 10 l50℃2 min

Forward primer 0.5 l95℃10 min

Reverse primer 0.5 l 95℃ 20 s40 个循环

ddH₂O8.2 l 6℃ 60s 40 个循环

cDNA0.8 l

Total20 l读取溶解曲线

5.6 Glyma.03g035300基因cds序列的克隆

5.6.1基因扩增

将所需扩增的基因配成50l体系，所需溶液及体积如下：

2phanta max buffer 25 l

dNTP mix ture4l

引物F2 l

引物R 2 l

酶 1 l

模板2 l

RNase Free ddH₂O 14 l

Total 50l

按以下条件反应

按下列条件进行反转录反应(前四步33Cycle):

94℃ 10 min

94℃ 30 s

55℃ 30 s

72℃ x(1000kb 1min)

72℃ 10min

4℃ forever

5.6.2凝胶回收

①　加入 buffer DE-A 300 l金属浴75℃,7min；

②　加入1/2 V_DE-A的DE-B（室温放置）；转移至2ML制备管的EP中，12000rpm离心1min，弃滤液；

③　将制备管置回2ML离心管，加500ML的buffer W1，12000rpm离心30S，弃滤液；

④　将制备管置回2ML离心管，加700ML的buffer W2，12000rpm离心30S，弃滤液；再以同样的方法加入加700ML的buffer W2，12000rpm离心1min，弃滤液；

⑤　将制备管置回2ML离心管，12000rpm离心1min；

⑥　将制备管置回1.5ML离心管，在制备管膜中央加入25去离子水(预热65℃）,室温静置1min，12000rpm离心1min送脱DNA.

5.6.3菌落PCR

①　连T载体系：4MLDNA 1ML载体，进行PCR；

②　转化：取50ML冰融化的感受态细胞，加入连接物，混匀，冰上放置30min；42℃热激化30S，立即置于冰上2min；加入450ML无抗生素的LB液体培养基，摇床220转，,37℃培养45min；将500ML的菌液4000rpm离心1min，弃去400ML，剩余100ML涂板；培养过夜（16h）；

③　第二天将生成的菌落进行PCR。

6、可行性分析

（1）国家大豆改良中心拥有较为完善的软硬件条件，可以完成该实验的所有步骤；

（2）实验室有过关于这方面的研究，研究方法较为成熟。

4. 参考文献

7、本项目的特色或创新之处

（1）利用qrt-pcr技术确定了候选基因是否受疫霉的诱导。

（2）克隆了该候选基因的cds序列，验证该基因的功能。

5. 计划与进度安排

8、计划及预期进展

2022年8月 开题，设定方案

2022年8月10月 根据方案，进行实验