应用微通道加快赖氨酸环化脱氨酶的催化速度开题报告

1. 研究目的与意义（文献综述包含参考文献）

文 献 综 述

1.1研究背景

近年来，分析装置的微型化已经成为一个重要的研究方向，芯片实验室技术的发展也因而得到广泛重视。芯片实验室(lab-on-a-chip)是系统集成和微刻技术发展的结晶，是可以完成生物化学分析的微型芯片。到目前为止，利用微刻技术的多种微流结构诸如阀、压力系统、测量系统、反应仓等已经被整合到芯片实验室中。最完整形式的芯片实验室可以完成样本的预处理、分离、稀释、混合、化学反应、检测以及产品的提取，因此也可以称为微完全分析系统(TAS)。微流动系统由于其尺寸微小，可减小流动系统中的无效体积，降低能耗和试样用量，且响应快，因此有着广泛的应用前景。

1.2研究目的

图1 哌啶甲酸的生物催化合成

哌啶甲酸(Pipecolic acid，简称PA)是一种重要的刚性环状非蛋白质氨基酸，它既可以限定多肽的构象，还可作为不同化合物合成库中的多功能骨架，所以广泛用于许多手性药物和生物活性物质的制备。哌啶酸的合成方法之一是生物催化合成。本课题组采用在大肠杆菌中异源表达的赖氨酸脱氨环化酶催化赖氨酸生产2-哌啶甲酸。赖氨酸脱氨环化酶催化赖氨酸的反应速率十分缓慢，因此我们需要寻找合适的方法以提高赖氨酸脱氨环化酶的催化速率。

在微纳米尺度下，流体间的传质、传热和反应过程高效、易控，主要是因为：（1）短程分子扩散有利于控制化学反应进程并且能够快速达到平衡状态；（2）相对较大的界面有利于促进界面反应；（3）反应发生时只需要少量热能、散热和加热过程都容易实现，能精确控制反应温度。相比于在摇床或者其他反应器中的反应过程，在微流体中这一系列特性都极大提高了反应的可控性。寻找合理的条件，应用微通道将可以提升赖氨酸脱氨环化酶的催化速率。这也是本课题研究的目的。

1.3微流体技术

1.3.1微流体技术定义

微流体技术是在微尺寸下控制、操作和检测复杂流体的技术，是在微电子、微机械、生物工程和纳米技术基础上发展起来的一门全新交叉学科。^[1]

1.3.2微流控技术的核心内容

1.3.2.1微通道结构的设计与制造

当通道的特征尺寸在微米甚至纳米量级时，通道表面积与其内部空间的体积之比很大，通道的结构、形状和壁面性质都将对其中的流体流动状态产生极大的影响。如何设计并制造出结构合理、尺寸精确、壁面性质可控的微通道，是控制微流体的前提。

1.3.2.2微纳尺度流体的驱动与控制

微纳尺度下的流体与宏观流体相比，其流动状态和传输特性有很大不同，表现出明显的尺寸效应^[2-3]。随着通道特征尺寸的缩小，流体的体积减小，重力往往可以忽略不计；但此时流体的比表面积增加，表面张力占据主导地位，通道中液-固、液-液及液-气界面的形态、尺寸和位置成为影响流体流动状态的主要因素之一。微纳流体流动的雷诺数（Re）极低，其值通常远小于100，属于典型的层流，流体黏度的影响远大于惯性的影响，流动阻力大，流体各部分混合困难。而另一方面，微纳流体流动的伯克利数(Peclet number)较大，流体中分子、原子或其他微观粒子的随机扩散过程将不可忽略。这些特点都使得微纳流体的驱动和控制较为困难。

1.3.2.3微流控器件及系统的集成与封装

微流控器件是目前微机电系统（MEMS）领域中主要的分支之一。随着制造和集成技术的不断提高，微流控器件也日益向小型化、多功能化方向发展。

1.4. 微通道的结构与制备

微流控系统中流体需要在一定尺寸和结构的微通道中以一定的方式进行流动，以达到传热、传质和动量传输的目的。因此微通道是微流控系统的核心部分。尺寸较大（特征尺寸大于100 m）、结构和功能简单的通道可以用毛细管制备，而尺寸小、结构复杂的通道则需要采用特定的材料和特定的工艺来制备。

1.4.1 微通道结构及其设计

微通道由入口、主通道、辅助通道（侧流通道）和出口组成。主通道中需要输入多相流体时，不同的流体需从不同的入口通道引入，经过主通道处理后的不同流体再由不同的出口通道导出。入口和出口 部 分 可 以 设 计 成T型^[4]，Y型^[5]，或扇骨型^[6-7]结构。主通道是流体发生分离、混合和反应的主要空间场所，是实现微流控器件功能的主要部分，其结构和尺寸需根据器件所要实现的具体功能进行仔细设计。最简单的通道为平面直通道^[8]，如图2 a）所示。在需要造成不同流体间的有效混合时，可以将主通道设计成二维曲线型^[9-10]、二维折线型^[10]、三维折线型^[11]或更为复杂的三维结构^[12]，如图2b）-图2e）所示。本课题研究实验中主要采用简单二维曲线型^[9-10]。

a）平面直通道；b）二维曲线型通道； c）二维折线型通道；d）三维折线型通道；e）复杂三维通道；f）底面有人字形槽的主通道

图2 不同形状的通道

Fig. 2 Microchannels of different morphology

1.4.2 制备微通道的材料

设计好的微通道结构可以用不同的材料来制备，如硅、玻璃及高分子聚合物等。其中有机聚合物材料加工制备过程简单^[17]，能够制备复杂的通道结构。可以用于制备微通道的有机聚合物材料主要有聚碳酸脂（polycarbonate, PC）^[14-15]、聚苯乙烯（polystyrene, PS）^[13-17]、聚乙烯对苯乙二醇（polyethylene terephthalate glycol, PETG）^[18]及聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane, PDMS）^[17]等。其中聚二甲基硅氧烷的弹性很好，可用于制备需要较大变形的特殊器件，如微气泵^[19]、微阀^[20]等。但有机物导热性差、不耐高温、加工工艺与微制造工艺不兼容，使其在微流控技术的应用受到一定限制。

1.4.3 微通道的加工制备方法

用于制备微通道的材料种类多、性能差异很大，针对不同的材料需要采用不同的加工方法。硅和玻璃材料上加工微通道主要采用光刻和刻蚀技术，可以精确地控制微通道的形状、大小和位置，并且能同时在整个芯片表面形成图形，适宜进行大规模批量生产。

聚合物类材料的加工方法则大不相同，通常采用软光刻技术^[20]来完成。软光刻所需要的设备比较简单，一般实验室环境下就可以应用，图形复制过程简单、精度高、重复性好，是一种方便、便宜、适合一般生产和实验环境条件并能进行低成本批量生产的技术。

1.5研究前景与意义

最近几年来,国内外学术界对微通道进行了深入的研究,对微通道反应器的原理和应用有了比较透彻的认识,在微通道反应器的设计、制造、集成和放大等关键问题上已经取得了突破性进展。微尺度流体的特殊性在研究中得到了揭示,微反应器优异的性能也随着研究过程的不断深入而逐渐被研究者们认知。作为一个新兴的领域,微通道反应器的应用将在以后的实验，生产中得到更广泛的应用。

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2. 研究的基本内容、问题解决措施及方案

2.1主要研究内容及要解决的问题

（1）微流体芯片的制作和使用

使用聚二甲基硅氧烷（pdms）浇注的方法制作微芯片。将配制好的pdms在负压环境下除去气泡后浇注在制作好的模具上，待固化后经过剥离、打孔、修剪和键合等步骤制作成带有微通道的芯片。联合使用微流泵，温控元件和微芯片，达到对于反应体系流速、温度和反应时间等因素的精确控制。