CRISPR/Cas9系统用于编辑大肠杆菌乳糖操纵子基因启动子序列开题报告

1．结合毕业设计（论文）课题情况，根据所查阅的文献资料，每人撰写

2000字左右的文献综述：

文 献 综 述

CRISPR/Cas9系统介导的基因组定点编辑技术

1.基因组编辑

基因组编辑是建立在基因靶向修饰的基础上，对生物基因组进行改造的一项新技术^[2]。基因组定点编辑技术，可以实现对一个或多个目的基因的敲除，或是把外源基因敲入到指定位点，也可以利用转录因子在转录水平上对目的基因的表达水平进行调控，这项技术是研究基因功能并对基因的功能加以利用的最有效手段^[1]。

科学家一直在寻求更加精确的方法对特定的基因进行高效、精确的敲除或编辑，并且对基因功能进行深入研究。20 世纪 80年代，研究者们可以利用同源重组的方法来对特定的基因进行靶向修饰，但由于自然重组的过程非常罕见，所以，这种方法效率非常低^[1]。人工核酸内切酶（Engineered end nuclease，EEN）方法的出现使基因靶向敲除变得简单，同时也提高了实验的重复性。ENN 能够通过特异性的核酸序列介导，利用核酸内切酶对特异性的 DNA 位点进行酶切，产生双链断裂切口（double strand breaks，DSB），当DNA 损伤时，细胞为防止 DNA 降解启动 DNA 的自我修复机制 ：同源重组（homologous recombination，HR）和非同源末端重组（Non-homologous end joining，NHEJ），对断裂的双链核酸进行修复。非同源末端重组修复过程极易产生碱基丢失，错配，在修复过程中会产生不等数目的碱基缺失或者插入，进而改变基因的密码子阅读框，使翻译后的蛋白质功能出现差异甚至失活^[4]。

基因组定点编辑工具主要有锌指核酸酶（Zinc-finger nucleases，ZFNs）、转录激活样效应因子核酸酶（Transcription activator-like effecter nucleases，TA-LEN）、归巢核酸内切酶（Mega nucleases）和成簇间隔短回文重复（The type II clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR），以上工具均可以对基因组进行精确的定点修饰，工作原理基于核酸内切酶在基因组的特定位点进行切割，从而形成DNA 双链断裂（Double strand break，DSB）基因组定点编辑工具主要有锌指核酸酶（Zinc-finger nucleases，ZFNs）、转录激活样效应因子核酸酶（Transcription activator-like effector nucleases，TA-LEN）、归巢核酸内切酶（Mega nucleases）和成簇间隔短回文重复（The type II clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR），以上工具均可以对基因组进行精确的定点修饰^[3]。

2. CRISPR/Cas9系统

CRISPR/Cas9基因编辑技术是继ZFN和TALEN技术之后迅速发展起来的第3代基因组编辑技术，该技术由细菌和古细菌中存在的Ⅱ型CRISPR/CAS获得性免疫系 统经人工改造而成。CRISPR是指规律成簇间隔短回文重复序列,而Cas是指CRISPR相关蛋白。因为CRISPR/Cas基因编辑技术是通过一段RNA来识别打靶位点,因此该技术也叫做RNA指导的核酸内切酶(RNA-guided endonuclease，RGEN)技术。与ZFN和TALEN技术相比,该技术不仅在设计、合成与筛选上更为简便、快捷,而且可以在1个细胞内同时进行多个基因的编辑，成倍的提高了基因编辑的效率。

2.1 CRISPR/Cas系统的结构

细菌生存的自然环境中同时存在着细菌病毒噬菌体。细菌在噬菌体的长期选择压力下，进化出多种防御机制，例如吸附抑制、DNA注入抑制、无效感染 以及限制-修饰系统等^[14]。CRISPR/Cas系统也是其中较为有效的一种获得性免疫机制。CRISPR簇是一个广泛存在于细菌和古生菌基因组中的特殊 DNA重复序列家族，其序列由一个前导区( Leader) 、多个短而高度保守的重复序列区(Repeat) 和多个间隔区(Spacer) 组成^[9]。

通过对CRISPR 簇侧翼序列分析发现，在其附近存在一个多态性家族基因，编码的蛋白质均含有可与核酸发生作用的功能域( 具有核酸酶、解旋酶、整合酶和聚合酶等的 活性)，并 且 与CRISPR区域共同发生作用，被命名为Cas基因，目前发现的有包括 Cas1 ~ Cas10等多种类型。基因与CRISPR共同进化，构成一个高度保守的系统^[8]。其中 Cas 基因家族中的 Cas9 广泛地应用于该系统中，它是一种天然存在的内切酶，具有两个酶切活性结构域 ：HNH 核酸酶结构域和 Ruv-C-like 结构域，分别切割互补链和非互补链。切割过程需要另外两个 RNA 的帮助，分别为 CRISPR RNA（crRNA）和反式 CRISPR RNA（trans -acting CRISPR RNA，tracrRNA），人们已经将这两种 RNA 改造融合成一个向导 RNA（single-guide RNA，sgRNA），单个 sgRNA 足以帮助 Cas9 实现定点切割的效果^［6］。

2.2 CRISPR/Cas系统的作用机制

到目前为止,虽然 CRISPR/Cas 系统的详细作用机制尚未完全阐明,但已基本明确了该作用机制的整个过程, 该过程大体分为 3 个阶段：在噬菌体入侵的起始阶段, Cas 蛋白复合物靶向并裂解噬菌体基因组中的原型间隔序列(protospacer), protospacer接下来整合到宿主基因组的 CRISPR 位点的 5′端;然后这些短的掺入的 protospacer 被转录成 crRNA;最后阶段是在 Cas 蛋白复合物的参与下, 靶向和干扰侵入的噬菌体 DNA 序列 ^[10]。当同种噬菌体再次入侵时, CRISPR的repeats序列截取和保留的入侵噬菌体的某些 DNA片段形成 spacers, spacers会转录形成一些小的 crRNA,这些 crRNA 会与 trans-activating crRNA(tracrRNA)形成一种双链二级结构,以此招募 Cas 蛋白, crRNA、tracrRNA 以及 Cas 蛋白形成复合体,识别紧随 protospacer 序列后的 PAM 序列, Cas 蛋白的核酸酶结构域对与 crRNA 互补的双链DNA 进行切割,从而使细菌具有对抗同类噬菌体再次入侵的能力^[11]。

2.3 CRISPR/Cas系统的分类

根据Cas基因核心元件序列的不同,CRISPR/ Cas免疫系统被分为3种类型：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。Ⅰ型和Ⅲ型 CRISPR/Cas 免疫系统需要多个 Cas 蛋白形成复合体切割 DNA 双链,而Ⅱ型 CRISPR/Cas免疫系统只需要一个 Cas9 蛋白来切割 DNA 双链,目前Ⅱ型系统是被改造的最为成功的人工核酸酶。体外实验证明 Cas9 基因是参与 CRISPR 免疫系统的唯一必需基因 ^[11], Cas9 是由1409个氨基酸组成的多结构域蛋白,含有2个核酸酶结构域：氨基端的RuvC-like 结构域及位于蛋白中间位置的 HNH 核酸酶结构域, HNH 核酸酶结构域可以切割与 crRNA 互补配对的模板链, 切割位点位于原型间隔序列毗邻基序(Protospacer adjacent motif, PAM)上游3nt处,RuvC-like 结构域可以对另一条链进行切割,切割位点位于PAM上游 3~8nt 处 ^[12]。在 crRNA 与tracrRNA 形成的双链 RNA 的指导下, Cas9 蛋白对靶位点进行切割。

3.Cas9/gRNA的体外构建步骤

研究人员发现 Cr-RNA 与 tracrRNA 形成的双链 RNA（guide RNA，gRNA）介导的双链 DNA 剪切系统的核心，人为的改造这一双链 RNA 可以了解细菌 Cas9 对不同物种的 DNA 系列进行任意的切割，gRNA 介导 Cas9 对靶基因进行切割并形成 DSB是实现基因修饰的基础。Hwang 等利用人工合成的 sgRNA 指导了细菌蛋白 Cas9 对斑马鱼胚胎基因进行了修饰，其效率类似于 ZFN 和 TALEN 技术。

Cas9/gRNA 系统体外构建的一般步骤：（1）从已知的序列中通过 PAM 进行定位寻找合适的靶位点并合成 gRNA，在设计靶位点应尽量靠近第一外显子附近，这样能够获得较高活性的 gRNA ；（2）将合成好的 gRNA 与 Cas9 序列构建重组质粒。目前在构建重组质粒过程中有两种主要方案 ：一是将gRNA 与 Cas9 连入同一个质粒载体中并以双启动子启动，载体中携带荧光报告基因（用于流式细胞仪筛选）或抗性基因（用于药物筛选）。二是将 gRNA与 Cas9 分别连载不同的载体上，两个载体携带有不同的荧光报告基因或抗性基因 ；（3）对构建好的重组质粒进行活性检测，即敲除活性的计算 ；（4）挑选活性较高的敲除质粒或者质粒对通过转染或者显微注射的方法导入培养的细胞或者生物体内进行基因组定点编辑操作 ；（5）利用测序、RFLP 等方法检测基因组定点修饰的结果。与ZFN、TALEN不同的是， Cas9 系统的 gRNA 的设计比较简单，而第 3 步的活性检测则关系到后期基因的敲除效率，为Cas9 系统实验过程中的关键一步^[4]。

4.总结与展望

如前所述，CRISPR/Cas9基因编辑系统诞生时间很晚但是它的发展却非常迅速，目前该技术成功应用于人类细胞、斑马鱼、植物和小鼠以及细菌的基因组精确修饰^[17]。另外最近的一项研究首次发现,无论在体外试验,CRISPR/Cas9系统可以对人类高度甲基化的SERPINB5基因位点进行识别和切割^[18]。虽然还需要用更多的甲基化位点来验证，但这已初步表明CRISPR/Cas9系统对打靶位点的识别可能并不受DNA甲基化状态的影响,即CRISPR/Cas9基因编辑系统的应用范围可能会更广。作为第3代基因编辑工具,CRISPR/Cas9系统的优势在于(1)设计和构建方法简单快捷,成本低廉。(2)基因编辑效率优于ZFN和TALEN系统(3)可同时实现多个基因的打靶。（4）可以方便快捷的改造为基因表达调工具。这些优势是传统基因修饰技术甚至第2代基因修饰技术所不具备的。因此我们有理由相信，目前尚未解决的问题会得到深入详细的研究，CRISPR/Cas9系统的基因编辑效率和特异性会得到进一步的优化和提升，甚至利用CRISPR/Cas9系统进行医学临床治疗也将指日可待。可以预期的是CRISPR/Cas9系统将会在生物学、医学的多个领域中得到广泛的应用,并对我们的生活产生深远的影响^[14]。

5.参考文献

[1]Jasin M. Genetic manipulation of genomes with rare-cutting endonucleases. Trends Genet,1996,12(6):224-8。

[2]吴璐,王磊,任远等.基因组编辑技术研究进展[J].生物技术通报,2014,11:84-90.

[3] Carroll D.Genome engineering with targetable nucleases. Annu Rev Biochem., 2014;83:409-39.

[4] Hwang WY, Fu YF, Reyon D, et al. Efficient genome editing in zebra fish using a CRISPR-Cas system［J］.Nature Biotechnology, 2013, 31（3）：227-229.

[5]Jinek M, Chylinski K, Ines Fonfara, et al. A Programmable Dual-RNA-Guided DNA End nuclease in Adaptive Bacterial Immunity［J］. Science, 2012, 337 ：816-821.

[6]Gasiunas G, Barrangou R, Horvath P, et al. Cas9-crRNA ribonucle-oprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2012,109：E2579-2586.

[7]方锐,畅飞,孙照霖等.CRISPR/Cas9介导的基因组定点编辑技术.生物化学与生物物理进展,2013,08:691-702.

[8]李辉,施振旦.CRISPR/Cas9新型基因打靶系统的研究进展.江苏农业学报，2013，04:907-911.

[9]Shan Q, Wang Y, Li J,et al.Targeted genome modification of crop plants using a CRISPR/Cas system. Nat biotechnol,2013,31(8):686-688.

[10]李铁民,杜波. CRISPR-Cas 系统与细菌和噬菌体的共进化.遗传, 2011, 33(3): 213218.

[11]李君,张毅,陈坤玲等.CRISPR/Cas系统:RNA靶向的基因组定向编辑新技术[J].遗传,2013,11:1265-1273.

[12]Friedland AE, Tzur YB, Esvelt KM, Colaiacovo MP, Church GM, Calarco JA. Heritable genome editing in C. elegans via a CRISPR-Cas9 system. Nat Methods,2013,10(8):741743.

[13]贾良杰. CRISPR/Cas基因组靶向编辑技术综述[J]. 中国医药导报，2014,22:154-1 56.

[14]刘志国.CRISPR/Cas9系统介导基因组编辑的研究进展[J].畜牧兽医学报，2014,10: 1567-1583.

[15]QI L S,LARSON M H, GILBERT L A, et al. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression [J].Cell,2013

152:1173-1183.

[16]MALI P,ESVELT K M,CHURCH G M.Cas9 as a versatile tool for engineering biology

[J].Nat Methods,2013,10:957-963.

[17]冯红,董阁,李维等. 原核CRISPR-Cas系统的结构功能及应用[J].四川师范大学学报(自然科学版),2014,02:268-281.

[18]HSU PD, SCOTT DA, WEINSTEIN JA, et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases[J].Nat biotechnol,2013,31(9):827-832.

２．本课题要研究或解决的问题和拟采用的研究手段（途径）：

1. 本课题研究的问题

本设计以大肠杆菌为研究对象，选择基因工程实验中的一个常用的标记基因lacZ基因，通过分析大肠杆菌乳糖操纵子基因启动子序列并设计靶向乳糖操纵子基因启动子序列的gRNA序列，构建相关gRNA载体，转化大肠杆菌感受态细胞，经细菌培养、抗生素药物筛选得到候选克隆，运用PCR、测序及lacZ酶活性测定等对候选克隆进行分析,探讨CRISPR/Cas9系统用于编辑改造大肠杆菌基因组序列的实验方案。

2. 本课题采用的研究手段

一．检索及分析大肠杆菌乳糖操纵子基因启动子序列。

二．设计并合成靶向乳糖操纵子基因启动子序列的gRNA序列。

三．构建gRNA载体质粒。

四．大肠杆菌感受态细胞制备，gRNA与pCAS9质粒共转化大肠杆菌感受态细胞，经细菌培养、抗生素药物筛选得到候选克隆。

五．通过PCR、测序筛选鉴定候选克隆。

六．lacZ酶活性测定。